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남윤석 전북대학교 일반대학원 2013 국내석사
This experiment was performed to find the effect of three different media in developing Hanwoo embryos from oocytes to blastocysts. For in vitro maturation, oocytes were collected from the ovary and placed either in the Brackett & Oliphant (BO), Tissue culture medium-199 (TCM-199), or IVMD101 (Research Institute for the Functional Peptides) media, containing 3% fetal bovine serum (FBS), 0.5㎍/㎖ follicle stimulating hormone (FSH), 0.5㎍/㎖ luterizing hormone (LH), and 1㎍/㎖ estradiol-17β (E2). For in vitro fertilization (IVF), the oocytes were transferred to the sperm droplets either in BO, TCM-199, or IVF100 (Research Institute for the Functional Peptides, Japan) media with 10% fetal bovine serum (FBS). After 22-24h IVF, embryos were transferred and cultured either in B.O. or TCM199 with 10% FBS until the embryo were hatched. For fertilization of the oocytes, frozen sperm from Hanwoo and Chikso (Korean brindle cattle) bulls were used. The cleavage rates were examined 2 or 3 days after IVF and the blastocyst rates were examined 7 or 8 days after IVF. The cleavage rates and the blastocyst rates from the experiment differ among the three different media. The lowest cleavage rate was in February in all three media. In TCM-199, the embryos with fertilized with Chikso sperm showed the highest cleavage rate of 55% in July. The oocytes fertilized with Hanwoo sperm developed to blastocysts in March and May, and the oocytes fertilized with Chikso sperm developed to blastocysts in October, December, April, and July. The reason for the differential blastocyst development between the embryos fertilized with either Hanwoo or Chikso sperm in the different season may be due to oocyte quality in the ovaries influenced by seasonal environments including the outside temperature and humidity.
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INTRODUCTION: Oxidative stress and chronic inflammation play important roles in the pathophysiology of endometriosis. However, their roles in female infertility remain unclear. The thiol-redox system participates in a variety of diseases related to oxidative stress. Oxidative stress induces the expression of inflammatory cytokines, which further promote oxidative stress. The role of these systems in the intrafollicular microenvironment of infertile patients with endometriosis is unknown. The aim of this study was to compare biomarkers of the thiol-redox system and chronic inflammation in infertile patients with and without endometriosis who were receiving in vitro fertilization (IVF). We also examined correlations between biomarker concentrations and IVF outcome. METHODS: Sixty-five patients receiving IVF were included in this prospective observational study. Patients were divided into two groups: 31 patients with endometriosis (endometriosis group) vs. 34 patients with unexplained infertility or infertility due to male or tubal factors (controls). Follicular fluid (FF) was obtained from a single dominant follicle during oocyte retrieval and stored at -70°C. Malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH), glutathione peroxidase (GPX)-3, thioredoxin (TRX), TRX-binding protein (TBP)-2, and peroxiredoxin (PRX)-4 levels were measured in the FF samples with enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) as biomarkers of oxidative stress. The inflammatory cytokines interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8, and tumor-necrosis factor (TNF)-α were also measured by ELISAs. Expression levels were compared between groups and statistically analyzed with a Student’s t-test or Mann-Whitney U test. Linear regression analysis was performed to correlate expression levels and IVF outcomes. Logistic regression analysis was performed to identify predictive factors for clinical pregnancy. RESULTS: GSH levels were significantly lower in the FF samples from the endometriosis group compared to those from the control group (12.73±5.67 vs. 16.19±6.94 µg/mL, P=0.033). TBP-2 levels were significantly higher in the FF samples from the endometriosis group compared to those from the control group (219.97±507.23 vs. 3.27±6.14 ng/mL, P=0.042). MDA, SOD, GPX-3, TRX, and PRX-4 levels were not significantly different between the two groups. MDA levels negatively correlated with TRX levels in FF (r=-0.264, P=0.047) and positively correlated with TBP-2 levels (r=0.354, P=0.009). SOD levels negatively correlated with PRX-4 levels in FF (r=-0.247, P=0.035). IL-6, IL-8, and TNF-α levels were significantly higher in the endometriosis group compared to those in the control (16.97±29.62 vs. 4.11±2.89 pg/mL, P=0.022; 216.26±95.73 vs. 171.50±72.06 pg/mL, P=0.037; 0.93±1.01 vs. 0.43±0.33 pg/mL, P=0.036, respectively). IL-1β levels were higher in the endometriosis group compared to those in the control, but differences were not significant. There were significant positive correlations among the four inflammatory cytokines. The levels of all of the inflammatory cytokines positively correlated with the levels of TRX in the FF samples. GSH levels were positively correlated with the number of high-quality embryos (r=0.299, P=0.024). GPX-3 and TRX levels were negatively correlated with the percentage of mature oocytes (r=0.275, P=0.046; r=0.398, P=0.004, respectively). TNF-α levels were negatively correlated with the cumulative embryo score per embryo (r=0.278, P=0.025). Logistic regression analysis revealed that the number of high-quality embryos was an independent factor predicting clinical pregnancy (OR 0.975, P=0.024). CONCLUSIONS: These findings suggest that there may be an imbalance of the thiol-redox system and increased levels of inflammatory cytokines in the intrafollicular microenvironment of infertile patients with endometriosis who are receiving IVF. These factors may affect the qualities of the oocyte and embryo.
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목적: 본 연구에서 체외수정시술 전 혈청 갑상선자극호르몬 농도와 갑상선자가항체의 유무가 체외수정시술 결과에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 방법: 본 연구는 전향적 관찰 연구로 2013년 3월부터 2017년 2월까지 불임증으로 첫 번째 체외수정시술을 시행한 260명의 여성들을 모집하였다. 과배란유도를 시작하기 직전 혈액 채취를 시행하여 갑상선자극호르몬 농도를 포함한 갑상선기능검사를 시행하고 thyroid peroxidase antibody, thyroglobulin antibody를 분석하였다. 통상적인 방법으로 체외수정시술을 한 후 결과를 추적관찰하였다. 자가항체 양성인 군과 음성인 군 간에 체외수정시술 결과 임상적 임신율, 유산율, 진행임신율에 차이가 있는지 분석하였다. 또한 TSH의 값에 따라 갑상선기능을 세분화하여 체외수정시술 결과에 미치는 영향도 분석하였다. 결과: 갑상선자가항체의 유병률은 15.0%(39/260)였다. 모두 215명의 여성(27명의 무증상갑상선기능저하증과 188명의 정상 갑상선기능을 가진 여성)에게 배아이식을 시행하였고, 갑상선자가항체 양성인 29명의 여성군과 음성인 186명의 여성군에서 진행임신율, 임상적 임신율, 유산율에 유의한 차이가 없었다. 혈청 갑상선자극호르몬 농도가 4.2µIU/mL 이상을 무증상갑상선기능저하증으로 정의하였을 때, 갑상선기능이 정상인 군에 비해 진행임신율이 유의하게 낮았다 [22.2% (6/27) vs. 44.7% (84/188), p=0.045]. 임상적 임신율 또한 유의하게 낮았으며 [33.3% (9/27) vs. 53.7% (101/188), p=0.047], 유산율에는 차이가 없었다. 또한 215명의 정상 갑상선 기능, 또는 무증상갑상선기능저하증 여성들 중 혈청 갑상선자극호르몬 농도가 3.4µIU/mL 이상인 여성들은 3.4µIU/mL 미만의 여성들에 비해 낮은 진행임신율 [23.9% (11/46) vs. 46.7% (79/169), p= 0.005]을 보였다. 임상적 임신율은 통계적으로 유의하지 않았으나 낮은 경향 [39.1% (18/46) vs. 54.4% (92/169), p=0.066]을 보였으며, 유산율이 유의하게 높았다 [38.9% (7/18) vs. 14.1% (13/92), p=0.020]. 다변수 로지스틱회귀분석을 시행하였을 때, 혈청 갑상선자극호르몬 농도가 3.4µIU/mL 이상인 인자(OR 0.375, p=0.013), 고령(OR 0.893, p=0.007)이 진행임신율을 유의하게 낮추는 독립인자였으며, 양질의 배아 수(OR 1.546, p=0.014)는 진행임신율을 유의하게 높이는 독립인자였다 결론: 결론적으로 갑상선자가항체는 그 자체로는 체외수정시술 결과에 영향을 미치지 않으며, 3.4µIU/mL이상의 혈청 갑상선자극호르몬 농도는 체외수정시술 후 낮은 진행임신율의 독립적으로 유의한 인자였다. AIM: This study aimed to investigate the impact of thyroid autoantibodies and serum thyroid stimulating hormone (TSH) level in infertile women on the clinical and ongoing pregnancy after in vitro fertilization (IVF) treatment. METHODS: This study included 260 Korean women who were scheduled for their first IVF cycle between March 2013 and February 2017. Just prior to ovarian stimulation for the first IVF cycle, serum levels of thyroid hormone, TSH, thyroid peroxidase antibody, and thyroglobulin antibody were measured. Clinical and ongoing pregnancy rates (PR) and miscarriage rates after IVF were prospectively analyzed according to thyroid autoimmunity and serum TSH levels. The primary outcome was ongoing PR beyond 12 weeks of gestation. RESULTS: The prevalence of positive thyroid autoantibodies was 15% overall (39/260). Embryo transfer was performed in 215 women (27 women with subclinical hypothyroidism and 188 euthyroid women). The clinical PR, ongoing PR, miscarriage rates were all similar between thyroid autoantibody-positive (n = 29) and negative women (n = 186). In women with subclinical hypothyroidism, ongoing PR was significantly lower than in the euthyroid group [22.2% (6/27) vs. 44.7% (84/188), p=0.045]. Clinical PR was also significantly lower [33.3% (9/27) vs. 53.7% (101/188), p=0.047], but miscarriage rate was not different. Among 215 women with subclinical hypothyroidism or euthyroid women, the group with serum TSH ≥ 3.4 µIU/mL showed a significantly lower ongoing PR than those with TSH < 3.4 µIU/mL [23.9% (11/46) vs. 46.7% (79/169), p= 0.005]. Clinical PR tended to be lower [39.1% (18/46) vs. 54.4% (92/169), p=0.066], and miscarriage rate was significantly higher [38.9% (7/18) vs. 14.1% (13/92), p=0.020]. In multivariate logistic regression analysis, serum TSH levels ≥ 3.4 µIU/mL (OR 0.375, p=0.013) as well as old age (OR 0.893, p=0.007) were independent unfavorable predictors for ongoing PR and the number of good-quality embryos was an independent favorable predictor (OR 1.546, p=0.014). CONCLUSION: Thyroid autoantibodies did not affect pregnancy or miscarriage after IVF, but infertile women with serum TSH level ≥ 3.4 µIU/mL demonstrated poor IVF outcomes.
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生殖醫學의 진보는 자연적인 생식방법으로는 子를 가질 수 없는 불임부부 등에게 희망을 성취시킬 수 있는 여러 가지 가능성을 실현해 왔다. 이에 따라서 체내인공수정이나 체외수정 그리고 대리모임신과 같은 補助生殖術은 이미 보편적인 불임치료의 수단으로 이용되고 있다. 그러나 보조생식술을 이용한 출산의 증가와 함께 많은 민사법적 문제들이 발생하게 되었지만, 보조생식으로 인한 子의 출산을 예견하지 못하고 제정된 민법을 비롯한 민사법 체계는 이를 규율할 수 있는 법규범으로서 기본적인 한계를 가지고 있다. 2005년부터 생명윤리및안전에관한법률’이 시행되었지만, 주로 생명윤리의 관점에서 생식세포의 매매금지나 배아의 보호를 위한 규제적 성격을 가지고 있을 뿐이어서 보조생식으로 인해 발생되는 법적 문제를 처리하는 기준으로는 미흡하다. 그러므로 보조생식으로 출생한 子의 친자법적 지위, 친자관계 결정 문제, 정자제공자의 법적 지위, 대리모계약의 유효성, 생식세포와 배아의 법적 성격 등에 대한 민사법적 문제점들은 현행 민법 등의 해석론이나 판례의 입장에 의해 규율될 수밖에 없다. 體內人工授精과 관련하여, 夫의 동의 없는 비배우자간 인공수정(AID)으로 출생한 子도 원칙적으로 모의 배우자인 夫의 친생자추정을 받는다고 해야 하고, 다만 이러한 子의 母와 그 배우자인 夫가 이미 이혼한 경우처럼 이미 보호할 가정의 평화가 존재하지 않는 경우에만 그 夫의 친생자추정이 미치지 않는다고 보아야 한다. 夫가 비배우자간 인공수정에 동의한 경우에, 인공수정자는 동의한 夫의 친생자추정을 받는다. 이 경우에 출생자와 모의 夫 사이에 자연적인 혈연관계가 없다는 것을 이유로 夫가 친생부인의 소를 제기하는 것은 신의칙 등에 반하는 것으로서 부정되어야 한다. 그리고 예외적으로 인공수정자에 대한 夫의 친자관계가 부정되고 정자제공자를 특정할 수 있는 경우에, 정자제공자가 任意認知를 하거나 인공수정자가 認知請求할 수 있는지의 문제가 발생하는데, 子와의 친자관계를 형성할 의사가 없었던 정자제공자가 법적인 친자관계를 인정받아 부양과 상속의무를 부담하는 것은 부당하므로고 이를 인정할 수는 없다고 본다. 體外受精에 관련하여, 체외수정의 유형 중에서 子의 출생을 의도하는 부부의 생식세포를 전혀 이용하지 않고, 모두 제공자의 난자나 정자만으로 체외수정하여 자를 출산하는 것은 입법적으로 금지해야 한다. 생식세포인 정자와 난자의 법적 성격에 대해서는, 인체으로부터 분리된 신체의 구성부분은 物件이라는 통설에 따라서 그 물건으로 인정하고 분리전의 귀속자가 그 소유권자라고 본다. 그러나 생명의 기초인 생식세포라는 특성상 인체로부터 분리된 정자나 난자에 대하여 일반적인 소유권의 내용이 그대로 인정될 수는 없다고 하겠다. 체외수정으로 생성된 배아의 법적 성격에 대하여는 배아가 인간으로 발현될 수 있는 가능성이 있는 존재라는 이유만으로, 배아에게 權利能力을 인정하는 명문의 규정이 없음에도 불구하고 보관중인 배아에게 비록 제한적이라도 권리능력을 인정할 수는 없다고 본다. 배아도 인체로부터 분리된 정자와 난자가 수정을 통해 결합된 것이고, 관리가능하고, 인체의 구성부분이 아니므로 이를 물건으로 보아 소유권의 객체가 된다고 해석해야 할 것이다. 따라서 원칙적으로 배아의 소유권은 배아를 구성하는 정자와 난자의 귀속권자인 체외수정을 시술받은 부부에게 있다고 본다. 다만 그 법적 성격을 물건으로 본다는 것은 배아가 動産과 동일한 고유의 성질이 있다는 의미가 아니라, 현행 민법상으로는 배아의 성격을 물건으로 취급할 수밖에 없다는 점에 의한 것이다. 그러나 이처럼 배아의 법적 성격을 물건으로 보아 소유권의 객체가 된다고 해석하는 경우에도, 자궁에 착상되면 세포분열, 성장, 分化를 통하여 인간 생명체로 발전될 수 있다는 그 잠재적 가능성을 고려하여 정자나 난자와 마찬가지로 動産에 대한 일반적인 所有權의 내용이 그대로 적용될 수는 없다고 본다. 대리모임신과 관련하여, 대리모계약의 효력을 인정하지 않는 견해의 주요 논거인 대리모계약이 민법 제103조의 반사회질서행위에 해당한다는 것은 ‘선량한 풍속’과 ‘사회질서’의 그 개념이 확정적인 것이 아닌 유동적인 개념이므로 그 효력을 부인할 수 있는 절대적인 근거는 아니다. 따라서 대리임신 ․ 출산에 대한 보상으로서 금전지급이 있는 代理母契約도 유효성을 인정하여 대리모계약에 수반되어 발생하는 법적 분쟁을 당사자들이 약정한 계약의 내용에 따라 규율할 수 있도록 하는 것이 타당하다. 그리고 대리모계약의 내용 중 일부가 계약당사자 일방에게 지나치게 불리하거나 불합리한 경우에는, 민법 제137조의 一部無效의 法理를 적용하여 원칙적으로 그 부분만을 무효로 보거나, 경우에 따라서는 계약전체를 무효화면 당사자 일방을 법적으로 보호할 수 있을 것이다. 그리고 대리모가 출산한 子에게 유전적인 모와 출산한 모(대리모)가 있는 경우에는 자연적 혈연관계를 중시하여 遺傳的인 母를 법적인 모로 인정해야 할 것이다. 그러나 이러한 민법을 비롯한 민사법에 대한 해석론만으로는 보조생식으로 인하여 발생되는 법적 문제점과 분쟁을 해결하는 것은 분명히 한계가 있으므로, 이를 구체적으로 규율할 수 있는 민법 등의 개정이나 특별법의 입법이 필요하다고 하겠다.
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