RANKL과 항체의약품 Denosumab 상호작용에 대한 구조 연구 = Structural study for the interaction of RANKL and a therapeutic antibody Denosumab

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Receptor activator of nuclear factor(NF)-κB ligand(RANKL) and its cognate receptor RANK is an essential mediator of osteoclast function and survival. Denosumab, a fully human monoclonal antibody against RANKL, inhibits osteoclastogenesis and is widely used not just for the treatment of osteoporosis, but for cancer. Here, we report the crystal structure of the Denosumab Fab fragment in complex with RANKL at resolution of 2.8 Å. This study revealed the key residues for Denosumab/RANKL interaction and suggested the mechanism of RANKL inhibition by blocking the approach of RANKL to RANK on membrane. These results also suggest potential residues for increasing affinity of Denosumab with RANKL.
The occasional emergence of pandemic influenza viruses which result in serious disease made evident the need for faster and higher-yield methods for the production of the influenza vaccine. Expression of fragments of the hemagglutinin(HA) protein in prokaryotic systems can be most efficacious strategy for the manufacture of large quantities of influenza vaccine in a short period of time. Using X-ray crystallography, we show that the receptor binding domain(RBD) of HA refolds spontaneously into its native, immunogenic structure even when expressed in an unglycosylated form in Escherichia coli. In the 2.8 Å structure of the HA-RBD, the data provide a structural basis for the rapid production of influenza vaccines in E. coli.
Myotubularin-related proteins are a large family of phosphatases that have the catalytic activity of dephosphorylating the phospholipid molecules phosphatidylinositol 3-phosphate and phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Each of the 14 family members contains a phosphatase catalytic domain, which is inactive in six family members owing to amino-acid changes in a key motif for the activity. All of the members also bear PH-GRAM domains, which have low homologies between them and have roles that are not clear. Here, the cloning, expression, purification and crystallization of human myotubularin-related protein 3 encompassing the PH-GRAM and the phosphatase catalytic domain are reported. Preliminary X-ray crystallographic analysis shows that the crystals diffracted to 3.30 Å resolution at a synchrotron X-ray source. The crystals belonged to space group C2, with unit-cell parameters ａ= 323.3, ｂ= 263.3, ｃ= 149.4Å, β= 109.7°.

국문 초록 (Abstract)

RANKL과 수용체 RANK는 파골세포의 기능과 생존에 필수적인 매개체이다. Denosumab은 RANKL과 결합하여 파골세포 생성과정을 저해하는 골다공증 완전인간 단일클론 항체 치료제이다. 본 연구는 단백질 결정학을 통해 RANKL과 결합한 Denosumab Fab 영역의 복합체의 구조를 2.8 Å의 해상도로 규명하였다. 구조 연구를 통하여 RANKL과 Denosumab의 상호작용에 중요한 잔기를 확인하고 Denosumab이 RANKL과 세포막의 RANK로의 결합하는 것을 막는 정확한 저해 작용기작을 이해할 수 있었다. 이러한 결과를 통해서 RANKL과 Denosumab의 결합력을 증가시킬 가능성이 있는 잔기를 제시하였다.
심각한 질병을 초래하는 유행성 독감 바이러스의 출현은 빠르고 고효율의 인플루엔자 백신 생산 방식을 요구한다. 원핵생물에서 헤마글루티닌(HA) 단백질의 단편을 발현시키는 것은 인플루엔자 백신을 단시간에 높은 효율로 대량 생산이 가능하게 할 것이다. X선 결정학을 통해 대장균에서 glycosylation 없이 발현된 HA 수용체 결합 영역(RBD) 단백질이 원래의 항원성을 갖는 형태로 refolding되는 것을 확인하였다. HA-RBD의 구조를 2.8 Å의 해상도로 규명하였고, 이를 통해 대장균을 이용한 인플루엔자 백신의 생산 가능성을 뒷받침하는 구조적 근거를 제시하였다.
Myotubularin-related protein(MTMR)은 탈인산화효소의 한 종류로 인지질 분자인 PtdIns 3-phosphate와 PtdIns 3,5-bisphosphate를 탈인산화시키는 활성을 가지고 있다. 14가지 family member들은 모두 탈인산화 활성에 관한 영역을 가지고 있지만 그 중 6개의 family member는 활성을 위한 중요 모티프의 아미노산 서열의 변화로 활성이 없는 영역을 가지고 있다. 또한 모든 MTMR들은 서로 유사성이 낮은 PH-GRAM 영역을 가지고 있으나 정확한 역할은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 인간 MTMR3의 PH-GRAM와 효소활성 도메인을 구조연구를 위해 복제, 발현, 정제, 결정화 단계까지 진행하였다. X선 회절 실험을 통해 3.3 Å 해상도로 데이터를 모았고, 공간군(space group)은 C2, 단위세포상수(unit-cell parameter) ａ=323.3, ｂ= 263.3, ｃ=149.4Å, β=109.7° 를 얻었다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. RANKL/Denosumab 결합복합체 구조 연구 1
• 1. 서론 1
• 1.1 Denosumab 1
• 1.2 연구 목적 5
• 2. 실험 재료 및 방법 6
• 2.1 유전자 클로닝 6
• 2.1.1 RANKL의 클로닝 6
• 2.1.2 Denosumab의 Fab 영역 클로닝 6
• 2.2 단백질 발현과 정제 8
• 2.2.1 RANKL 단백질 정제 8
• 2.2.2 Denosumab의 Fab 영역 단백질 정제 9
• 2.2.3 RANKL과 Denosumab의 Fab 영역 단백질 복합체 정제 10
• 2.3 결정화 11
• 2.4 X선 회절 실험 11
• 2.5 구조 결정 12
• 3. 실험 결과 및 토론 13
• 3.1 유전자 클로닝 13
• 3.1.1 RANKL의 클로닝 13
• 3.2 단백질 발현과 정제 14
• 3.2.1 RANKL 단백질 정제 14
• 3.2.2 Denosumab의 Fab 영역 단백질 정제 16
• 3.2.3 RANKL과 Denosumab의 Fab 영역 단백질 복합체 정제 19
• 3.3 결정화 21
• 3.4 RANKL과 Denoumab Fab 영역 복합체의 결정 구조 규명 22
• 3.5 토론 26
• Ⅱ. 대장균에서 발현된 헤마글루티닌의 구조 연구 27
• 1. 서론 27
• 1.1 헤마글루티닌 27
• 1.2 연구 목적 29
• 2. 실험 재료 및 방법 30
• 2.1 유전자 클로닝 30
• 2.2 단백질 발현과 정제 30
• 2.3 결정화 32
• 2.4 X선 회절 실험 32
• 2.5 구조 결정 33
• 3. 실험 결과 및 토론 34
• 3.1 유전자 클로닝 34
• 3.2 단백질 발현과 정제 35
• 3.3 결정화 38
• 3.4 헤마글루티닌 수용체 결합 영역 구조 규명 39
• 3.5 토론 41
• Ⅲ. Myotubularin-related protein 3 구조 연구 42
• 1. 서론 42
• 1.1 Mytotubularin-related protein 42
• 1.2 연구 목적 44
• 2. 실험 재료 및 방법 45
• 2.1 유전자 클로닝 45
• 2.2 단백질 발현과 정제 45
• 2.3 결정화 47
• 2.4 X선 회절 실험 47
• 3. 실험 결과 및 토론 48
• 3.1 유전자 클로닝 48
• 3.2 단백질 발현과 정제 49
• 3.3 결정화 51
• 3.4 X선 회절 실험 52
• 3.5 토론 53
• Ⅳ. 결론 54
• 참고문헌 56
• 국문초록 59