Effect and mechanism of sheet-type adipose-derived stem cells in diabetic wound healing

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chronic wounds such as diabetic ulcers are a significant global health problem despite the ongoing efforts to prevent and treat them. The characteristics of diabetic wounds are functional impairment of fibroblasts and keratinocytes that play critical role in wound healing and elevated MMPs, which results in the destruction of healthy extracellular matrix (ECM). Treatment of diabetic wounds still remains a clinically difficult problem.
Stem cells are a new hope to improve impaired diabetic wound healing. Among peripheral stem cells, adipose-derived stem cells (ASCs) are an attractive source with advantages of easy cell harvesting and culturing. Traditionally, cultured ASCs are individualized through trypsinization and applied in suspension state. However, the suspension method has many disadvantages such as destruction of cellular structure and function and low efficiency. Therefore, we used a photothermal ASCs sheet harvesting technique to preserve cell to cell and cell to ECM contact.
In this study, we hypothesized that maintained intercellular adhesion of sheet-type ASCs promotes diabetic wound healing by enhanced paracrine effect. To verify it, we planned the following experiments.
In vitro, we investigated growth factor release over time from sheet-type ASCs and the effect of sheet-type ASCs on human dermal fibroblasts(HDFs) and human keratinocytes(HKs) obtained from diabetic patients. Furthermore, we examined the mechanism of the enhanced paracrine function of sheet-type ASCs by electron microscopy and cell adhesion molecule blocking study. In vivo, we compared the wound healing effects of sheet-type ASCs with conventional dressing in diabetic mouse wound model.
Our data demonstrate that the sheet-type ASCs secreted more growth factors such as VEGF, PDGF and FGF to accelerate the diabetic wound healing. The augmented paracrine function of the sheet-type ASCs enhanced the proliferation and migration of both HDFs and HKs as well as the production of ECM components such as collagen 1. Moreover, elevated MMP-1 in diabetic skin was significantly reduced in sheet-type ASCs treated groups. In a mechanistic study of sheet-type ASCs, we found that blocking calcium dependant adhesion molecules resulted in decreased growth factor release and disruption of cell to cell adhesion.
The wound healing effect of sheet-type ASCs in diabetic mouse wound model was verified in vivo, showing that the application of sheet-type ASCs significantly enhanced wound closure rate and accelerated re-epithelialization at the wound edge.
In conclusion, sheet-type ASCs improved cell migration and proliferation, secretion in HDFs and HKs, and wound healing rate in diabetic mouse via enhanced paracrine effect. Maintaining intercellular adhesion via calcium dependent adhesion molecules is essential to the function and shape of sheet-type ASCs.

국문 초록 (Abstract)

당뇨병으로 인한 궤양은 만성 창상의 가장 많은 원인 중의 하나로 이 중에서 약 3-5%, 세계적으로 매년 약 100만명 이상이 결국 다리를 절단하게 되는 난치성 질환이다. 이에 대한 치료방법으로 과거에는 단순드레싱, 음압치료, 성장인자치료 등이 사용되었으나 그 효과에 한계가 있어 최근에는 줄기세포치료가 많이 연구되고 있다.
성체줄기세포 중 지방유래줄기세포는 쉽게 많은 양을 채취할 수 있고 배양이 잘되는 등의 장점으로 최근에 줄기세포치료제로 각광받고 있다. 지방줄기세포의 측분비 효과(paracrine effect)는 피부의 창상치유를 촉진시키는 주요기전으로 알려져 있다. 그러나 기존의 지방줄기세포 처리 방식은 단백분해효소를 통해 세포와 세포간의, 세포와 세포외 기질간의 접촉을 분리시킴으로써 이러한 측분비 효과가 저하될 가능성이 있다.
이에 본 연구에서는 인간 지방유래 줄기세포(human adiposederived stem cells, ASCs)를 지방조직으로부터 분리 배양한 후 비침습적 광열기술을 이용하여 시트 형태로 수확하여 당뇨창상에 대한 치유 효과를 확인하고, 그 기전을 알아보았다.
시트형 지방줄기세포(sheet-type ASCs)가 창상치유에 도움이 되는 VEGF, PDGF, FGF 등의 성장인자를 상당 시간동안 지속적으로 분비함을 확인하였다. 또한 시트형 지방줄기세포의 배양액이 당뇨환자에서 얻은 섬유모세포의 증식과 이동 뿐만 아니라 각질형성세포의 이동도 촉진시킴을 확인하였다. 또한 제1형 콜라겐과 같은 세포외기질(extracellular matrix)의 분비를 증가시킴과 동시에, 이를 분해하는 MMP-1을 당뇨군에서 유의하게 감소시킴으로써 창상치유에 유리하게 작용함을 확인하였다.
시트형 지방줄기세포의 기전과 관련해서 칼슘 의존형 부착분자(calcium dependent adhesion molecule)를 차단해본 결과 VEGF,PDGF의 측분비 효과가 감소하고, 전자현미경상에서 세포간 접촉이 분리되는 것을 확인하였다. 이는 칼슘 의존형 부착분자가 시트형태의 유지와 기능에 밀접히 관련되어 있음을 의미한다.
In vivo 실험은 당뇨쥐를 이용하여 마우스의 등배부에 8mm지름의 전층 피부결손을 만든 후 지방 유래 줄기세포를 시트 형태로 적용하였고, 이를 대조군과 비교하였다. 육안 비교와 H&E 염색에서 대조군에 비하여 시트형 지방줄기세포를 적용한 실험군에서 빠른 재상피화를 확인하였다.
시트형 지방줄기세포는, 기존의 방법과는 달리 단백 분해효소를 사용하여 세포를 분리하지 않기 때문에 세포간의 접촉이 보존되어 더 많은 성장인자를 분비할 수 있었고, 창상에서도 그 치유효과를 확인할 수 있었다. 이 연구결과는 앞으로 당뇨성 만성창상에 지방줄기세포가 부착된 시트형 치료제 개발에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 기대된다.