MECHANISM OF GLYCOSIDE HYDROLASE FAMILY 31 : MECHANISTIC PLASTICITY OF GLYCOSIDIC BOND CLEAVAGE

국문 초록 (Abstract)

글라이코사이드 가수분해효소군 31은 글라이코사이드에 대해서 여러 가지의 다른 반응을 촉매 하는 효소들로 이뤄져 있다. 이 반응들 중 대표적인 것으로 일반적인 리테이닝 글라이코시데이즈들이 행하는 반응센터의 입체구조의 불변을 수반하는 가수 분해 외에도 특이하게도 제거반응이 있다. 같은 유전자군내의 효소들의 구조와 반응메커니즘은 일반적으로 보존되기 때문에 이 두 반응의 메커니즘은 비슷할 것으로 예상된다. 이에 이 효소군 31의 세가지 효소에 대하여 연구가 수행되었다. 아스퍼질러스 나이저로부터 분리된 리테이닝 알파-글루코시데이즈가 이중 치환 메커니즘을 이용한다는 것이 밝혀졌는데 이를 위하여 메커니즘 응용 활성저하시약인 5-플루오로-알파-글루코실 플루오라이드를 이용하여 공유결합 중간체가 존재한다는 것을 밝혔다. 중간체를 만드는데 참여하는 아미노산 잔기는 224번 아스파테이트라는 것이 병렬식 메스 스펙트럼을 이용하여 밝혀졌는데 이 잔기는 효소군 31을 통틀어 보존되어 있는 잔기이고 이전부터 중간체의 공유결합에 참여할 것으로 제시되어왔다. 가수분해효소군에 속해 있으면서도 알파-1,4-글라이코시딕 결합을 가수분해가 아닌 제거반응으로 끊어내는 특이한 효소인 알파-1,4-글루칸 라이에이즈에 대한 연구가 뒤따랐다. 또 다른 알파-글루코시데이즈의 인히비터인 5-플루오로-베타-아이도실 플루오라이드와의 반응을 통하여 이 효소 또한 공유결합 반응 중간체를 형성한다는 것이 밝혀졌으며 이는 가수분해 효소와의 공통적인 메커니즘을 수행한다는 강력한 증거중의 하나이다. 이 시약에 의하여 표지가 된 아미노산 잔기 또한 이 효소군에 공통적인 553번 아스파테이트, 즉 이미 앞에서 밝혀진 알파-글루코시데이즈의 224번 아스파테이트에 해당한다. 상세한 메커니즘 연구도 수행되었다. 산도에 따른 활성 변화도는 종모양을 띄며 이는 엑티브 사이트에 이온화하는 그룹이 두 개는 존재함을 의미한다. 이 효소의 일련의 아릴글루코사이드 기질들에 대한 두 반응속도상수들의 로그치와 산성분해상수의 상관관계를 관찰하는 브뢴스테드 상관관계를 보면 둘 다 하강직선을 보여주며 브뢴스테드 상수는 각각 -0.32, -0.33이다. 이 브뢴스테드 상수는 의미 있는 크기 (1.16 ? 1.19) 를 보여주는 알파 2차 중수소 동위원소 속도효과와 더불어 반응의 첫 단계인 글라이코실레이션의 전이상태에 글라이코시딕 결합이 크게 잘라져 있으며 동시에 수소이온이 리빙그룹의 산소에 상당부분 전달되어있는 상태라는 것을 보여준다. 이에 따라 반응탄소원소에 양전하가 발생하게 되는데 이는 아카보스와 1-디옥시노지리마이신에 의한 강력한 활성저하 효과에 의하여도 증명이 되며, 강한 음전기성을 띤 플루오린에 의한 반응탄소의 옆 수소의 치환에 의한 반응 속도 저하 현상을 통하여도 증명이 된다. 오로지 하나의 기질만이 효소반응의 두번째 단계인 제거반응 단계가 속도 결정단계였는데 이는 5-플루오로 알파-글루코실 플루오라이드이다. 이 기질과의 반응에서 1번 탄소에서 알파 2차 중수소 동위원소 속도효과의 큰 값이 측정되었고 (1.23), 2번 탄소에서 1차 중수소 동위원소 속도효과의 비교적 작은 값이 측정되었다 (1.92). 이는 제거반응의 메커니즘이 E1 성질을 상당히 띤 E2 반응 메커니즘임을 보여준다. 라이에이즈 반응 메커니즘과 가수분해 효소 메커니즘과의 이런 전반적인 유사성은 글라이코시딕 결합 분해에 있어서의 진화를 통한 메커니즘적인 유연성을 의미한다. 마지막으로, 이콜라이로부터 아미노산 잔기 배열이 효소군 31의 효소들과 유사성을 가진 단백질 (YicI) 을 복제하였고 이 단백질이 ?알파-자일로시데이즈라는 것을 밝혔다. 이를 위하여 두 개의 메커니즘 응용 활성저하시약이 새로이 합성되었으며 이들은 (5S)와 (5R)-5플루오로-알파-자일로실 플루오라이드이다. 이 새로운 시약들은 자일로시데이즈의 활성을 저하시켰으며 또한 반응에 관여하는 아미노산 잔기를 표지하였다. 이 아미노산 잔기는 이 효소군 31에 공통적인 416번 아스파테이트로서 전 효소군에 걸친 메커니즘의 일치성을 보여준다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Glycoside hydrolase (GH) family 31 contains enzymes that catalyze several different reactions on glycosides. These include a nucleophilic substitution reactions with net retention of stereochemistry, common to retaining glycosidases, as well as an unusual β-elimination reaction. Since structures and mechanism are expected to be conserved in the same gene family, the two mechanisms were expected to feature common aspects. Three different GH family 31 enzymes were therefore studied.
A double displacement mechanism for the retaining α-glucosidase from Aspergillus niger was shown via trapping of a covalent glycosyl-enzyme intermediate with the mechanism based inactivator 5-fluoro-α-D-glucopyranosyl fluoride. The amino acid residue involved, Asp 224, was identified by LC MS/MS analysis of proteolytic digests. This residue is fully conserved in GH family 31 and has been suggested to be the catalytic nucleophile.
An unusual GH family 31 enzyme, the α-1,4-glucan lyase from Gracilariopsis sp. (GLase) that cleaves the glycosidic bond of α-1,4-glucans via a net β-elimination reaction was also studied. The trapping of a covalent glycosyl-enzyme intermediate using 5-fluoro-β-L-idopyranosyl fluoride, another mechanism based inactivator of α-glucosidases, strongly suggests that the mechanism also involves the formation of a covalent intermediate like that of α-glucosidases. The labeled amino acid residue was confirmed to be the highly conserved Asp 553, equivalent to Asp 224, the catalytic nucleophile in α-glucosidase from A. niger. A detailed mechanistic evaluation was also carried out. A classical bell shaped pH dependence of k_(cat)/K_(m) indicates two ionizable groups (pK_(a)₁ = 3.1, pK_(a)₂ = 6.7). Brønsted relationships of log k_(cat) versus pK_(a) and log (k_(cat)/K_(m)) versus pK_(a) for a series of aryl glucosides both show a linear monotonic dependence on leaving group pK_(a) with low β_(lg) values of -0.32 and -0.33, respectively. The combination of these low β_(lg) values with large α-secondary deuterium kinetic isotope effects (k_(H)/k_(D) = 1.16 ~ 1.19) on the first step indicate a transition state for the glycosylation step with substantial glycosidic bond cleavage and proton donation to the leaving group oxygen. Substantial oxocarbenium ion character at the transition state is also suggested by the potent inhibition afforded by acarbose and 1-deoxynojirimycin and by the substantial rate reduction afforded by adjacent fluorine substitution. For only one substrate, 5-fluoro-α-D-glucopyranosyl fluoride, was the second, elimination, step shown to be rate-limiting. The large α-secondary deuterium kinetic isotope effect (k_(H)/k_(D) = 1.23) at C1 and the small primary deuterium kinetic isotope effect (k_(H)/k_(D) = 1.92) at C2 confirm an E2 mechanism with considerable E1 character for this second step. This considerable structural and mechanistic similarity with retaining α-glucosidases is a clear example of the mechanistic plasticity of glycosidic bond cleavage through evolution.
Finally, an unknown protein (yicI) whose sequence has high similarity with GH family 31 was cloned from E. coli. and shown to be an α-xylosidase. Two new mechanism-based inactivators for α-xylosidases, (5S)- and (5R)-5-fluoro-α-Dxylopyranosyl fluorides were synthesized and shown to inactivate this enzyme. The amino acid residue labeled by these inactivators was identified as the invariant catalytic aspartate residue Asp 416, demonstrating the integrity of the mechanism within this gene family.

목차 (Table of Contents)

• Abstract = ⅱ
• TABLE OF CONTENTS = ⅳ
• LIST OF FIGURES = ⅹ
• LIST OF SCHEMES = ⅹⅴ
• LIST OF TABLES = ⅹⅴⅱ
• LIST OF ABBREVIATIONS = ⅹⅰⅹ
• ACKNOWLEDGEMENTS = ⅹⅹⅰ
• Chapter Ⅰ. Introduction = 1
• 1.1. Enzymatic Cleavage of the Linkage between Two Sugars = 2
• 1.1.1. Nucleophilic Substitution: Glycosyl Transfer = 3
• 1.1.2. β-Elimination = 4
• 1.2. Reaction Mechanisms of the Enzymatic Cleavage of the Linkage between Sugars = 5
• 1.2.1. Cleavage of a Glycosidic Bond by Nucleophilic Substitution: Glycosidases = 5
• 1.2.2. Eliminative Cleavage: Polysaccharide Lyases = 12
• 1.3. Bioinformatics Applied to Enzymatic Glycosidic Bond Cleavage = 14
• 1.4. Glycoside Hydrolase Family 31 = 16
• 1.4.1. α-Glucosidases = 17
• 1.4.2. α-Xylosidases = 20
• 1.4.3. α-1,4-Glucan Lyases = 22
• 1.5. Mechanism Based Inactivators in Mechanistic Studies of Enzymatic Glycosidic Bond Cleavage = 27
• 1.5.1. Irreversible Inhibitors = 27
• 1.5.2. Fluorosugars = 29
• 1.6. Aims of Study = 32
• Chapter Ⅱ. Identification of the Catalytic Nucleophile of Glycoside Hydrolase Family 31 α-Glucosidase from Aspergillus niger = 33
• 2.1. Background = 34
• 2.2. Kinetic Evaluation of Aspergillus niger α-Glucosidase = 35
• 2.3. Kinetic Evaluation of the Interaction of Aspergillus niger α-Glucosidase with 5-Fluoro-α-D-Glucopyranosyl Fluoride = 38
• 2.4. Identification of the Catalytic Nucleophile of Aspergillus niger α-Glucosidase = 42
• 2.5. Conclusion = 47
• Chapter Ⅲ. Detailed Mechanistic Study on an α-1,4-Glucan Lyase from Gracilariopsis sp. = 48
• 3.1 Background = 49
• 3.2. Previous Studies on the Mechanism of α-1,4-Glucan Lyase = 50
• 3.3. Probable Mechanisms = 52
• 3.3.1. Enzymatic Elimination Reactions = 52
• 3.3.2. Possible Mechanisms = 53
• 3.4. The Reaction of the α-1,4-Glucan Lyase from Gracilariopsis sp. with Various Substrates = 56
• 3.4.1. Commercially Available Substrates = 56
• 3.4.2. Synthetic Aryl Glycoside Substrates = 59
• 3.5. Active Site Environments - pH Dependent Activity = 64
• 3.6. A Covalent Intermediate and Two-Step Mechanism = 65
• 3.6.1. Background = 65
• 3.6.2. Reaction of α-1,4-Glucan Lyase from Gracilariopsis sp. with 5FαGlcF = 67
• 3.6.3. The Reaction of α-1,4-Glucan Lyase from Gracilariopsis sp. with 5FβIdoF = 69
• 3.6.4. The Reaction of α-1,4-Glucan Lyase from Gracilariopsis sp. with 2FαGlcF and 1FGlcF = 76
• 3.7. Transition State Structure = 77
• 3.7.1. The First Step - Glycosylation, Part 1: Brønsted Relationship = 77
• 3.7.2. The First Step - Glycosylation, Part 2: Fluorosugars and Inhibitors = 80
• 3.7.3. The First Step - Glycosylation, Part 3: Kinetic Isotope Effects = 85
• 3.7.4. Formulating the Transition State Structure of the First, Glycosylation, Step = 88
• 3.7.5. Speculations on the Transition State Structure of the Second, Elimination, Step from the Measurement of Kinetic Isotope Effects = 90
• 3.8. Speculations on the General Base Acting in the Second Step = 93
• 3.9. Conclusion = 94
• Chapter Ⅳ. Cloning and Kinetic Study of a GH Family 31 α-Xylosidase from Escherichia coli. = 97
• 4.1. Background = 98
• 4.2. Sequence Alignment Analysis of yicI Gene Product from E. coli = 99
• 4.3. Cloning and Overexpression of the yicI Gene = 101
• 4.3.1. The Amplification and Cloning of yicI Gene = 101
• 4.3.2. Overexpression of the yicI Gene = 103
• 4.4. Characterization of the Protein Encoded by yicI = 105
• 4.4.1. Molecular Weight and Analysis of Tryptic Fragments = 105
• 4.4.2. Substrate Specificity = 106
• 4.4.3. Factors Affecting the Activity of α-Xylosidase from E. coli (yicI) : pH, Temperature and Metal Ions = 108
• 4.5. Kinetic Evaluation of New Mechanism-Based Inactivators for Xylosidase from E.coli = 111
• 4.5.1 α-Xylosidases in Nature = 111
• 4.5.2 Synthesis of (5S)- and (5R)-5-Fluoro-α-D-Xylopyranosyl Fluorides = 112
• 4.5.3 The Inactivation of α-Xylosidase from E. coli with 5-Fluoro-α-D-Xylopyranosyl Fluorides, 4.3 and 4.4 = 114
• 4.6 The Identification of the Catalytic Nucleophile of the α-Xylosidase from E. coli = 126
• 4.7 Conclusion = 131
• Concluding Remarks = 132
• Chapter Ⅴ. Experimental Methods = 133
• 5.1. Synthesis = 134
• 5.1.1. General Methods = 134
• 5.1.2. General Materials = 135
• 5.1.3. General Synthesis = 136
• 5.1.4. Synthesis of Aryl α-D-Glucopyranosides = 138
• 5.1.5. Synthesis of (5S)-and (5R)-5-Fluoro-α-D-Xylopyranosyl Fluorides = 149
• 5.2. Enzymes = 154
• 5.2.1. Materials and Methods = 154
• 5.2.2. Cloning and Overexpression of the Gene (yicI) Encoding α-Xylosidase from Escherichia coli = 155
• 5.2.3. Enzyme Kinetics = 159
• 5.2.4. Trapping of the Covalent Glycosyl-Enzyme Intermediate and Identification of the Labeling Site by Tandem Mass Spectrometry = 167
• Appendix A. Crystal Structure of 5-Fluoro-Xylosyl Fluorides: Conformational Analysis = 171
• A.1. Anomeric Effect = 172
• A.2. The Anomeric Effect in Xylosyl Halides = 175
• A.3. Analysis of Crystal Structures of 5-Fluoro-α-D-Xylopyranosyl Fluorides = 177
• Appendix B. Kinetic Isotope Effects = 188
• B.1. Primary Kinetic Isotope Effect = 189
• B.2. Secondary Kinetic Isotope Effects = 192
• Appendix C. Graphical Representation of Data = 195
• REFERENCES = 204