Comparison of age-related sensitive biomarkers against cisplatin-induced renal toxicity in Sprague-Dawley rats = Sprague-Dawley 쥐에서 시스플라틴에 의해 유도되는 급성 신손상 진단을 위한 연령에 따른 민감한 biomarker 비교 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cisplatin (CDDP) is widely used as a chemotherapeutic agent for the treatment of several solid tumors. However, acute kidney injury (AKI) is occurs in a half of CDDP-treated patients. Traditional biomarkers including blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) are still used for detection of CDDP-induced AKI, but these biomarkers are not specific or sensitive. In addition, age is a factor that needs to be considered in drug therapy and the responsiveness of children may differ from adults receiving CDDP treatment. Therefore, the present study was identified specific and sensitive biomarkers of CDDP-induced renal injury with emphasis on 3-week-old rats with comparison to 20-week-old rats. All animals were single injected with CDDP (10 mg/kg, i.p.). After 3 days, all animals were sacrificed and serum, urine, and kidney tissues were collected. CDDP-induced proximal tubular damage was apparent from histopathological examination, being more severe in 3-week-old rats accompanied by increased number of TUNEL-positive apoptotic cells. This was associated with elevated urinary kidney injury molecule-1 (KIM-1), glutathione-S-transferase alpha (GST-α), vascular endothelial growth factor (VEGF), and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1). Moreover, KIM-1 mRNA levels in the kidney and urinary excretion levels of KIM-1 were significantly increased in 3-week-old rats. Taken together, these results suggest that the use of multiple methods including urinary excretion levels and Multiplex assay are appropriate to identify age-specific biomarkers for CDDP-induced AKI. Especially, significant increases in urinary KIM-1, GST-α, TIMP-1, VEGF levels may help to early diagnosis of young patients with CDDP-induced AKI.

국문 초록 (Abstract)

시스플라틴은 고형종양의 치료에 효과적인 항암제로 광범위하게 사용되고 있다. 하지만, 급성 신손상은 시스플라틴을 치료받는 환자들 중 50%정도가 발생한다. 시스플라틴에 의해 유도되는 신손상을 진단하는 biomarker로는 현재까지도 요소질소와 혈청 크레아티닌이 사용되고 있다.


하지만, 요소질소와 혈청 크레아티닌은 신장에 특이적이고 민감하지 않다. 게다가, 연령은 약물치료를 받을 때 고려되어야 할 필수적인 요소이고, 시스플라틴 치료를 받을 때 어린 환자들에게 나타나는 민감성은 성인 환자들과 다르다. 따라서, 본 연구에서는 시스플라틴에 의해 유도되는 급성 신손상을 진단할 수 있는 특이적이고 민감한 biomarker를 20주령 수컷 흰쥐와 비교를 통해3주령 수컷 흰쥐에 중점을 두고 확인해 보고자 하였다. 3주령 수컷 흰쥐와 20주령 수컷 흰쥐에 시스플라틴을 10 mg/kg 복강 투여하였다. 3일 후에 해부하였고, 혈액과 뇨 그리고 신장조직을 실험에 사용하였다. 조직병리학적으로 3주령 흰쥐가 20주령 흰쥐에 비해 시스플라틴에 의한 근위세뇨관 손상이 좀더 심각한 것을 관찰할 수 있었다. 세포 자멸사는 TUNEL 염색으로 확인할 수 있는데, 본 연구에서 시스플라틴을 투여받은20주령 흰쥐보다 3주령 흰쥐에서 근위세뇨관의 TUNEL 양성 세포가 유의성 있게 증가하는 것으로 관찰되었다. Multiplex assay 실험을 통해서 뇨에서의 KIM-1, GST-α, VEGF, TIMP-1 신손상 biomarker들이 3주령 흰쥐에서 유의성 있게 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다. 게다가, western blot 실험을 통해서 뇨에서의 KIM-1 biomarker발현이 시스플라틴을 투여받은 3주령 흰쥐에서 유의성 있게 증가

하는 것을 관찰 할 수 있었고, RT-PCR을 통해 신장조직에서의 KIM-1 mRNA 발현양상 또한 시스플라틴을 투여받은3주령 흰쥐에서 상당히 중가하
는 것을 확인 할 수 있었다. 실험 결과를 종합해 보면, 본 연구는 Multiplex assay를 통한 신독성 biomarker 분비량, 뇨에서의 신독성 biomarker 발현 정도 비교를 포함한 다양한 방법을 사용해서 시스플라틴에 의해 유도되는 급성 신손상 진단을 위한 연령에 따른 특이적인 biomarker의 차이를 좀 더 정확하게 확인할 수 있었다. 특히, 뇨에서의 KIM-1, GST-α, TIMP-1, VEGF biomarker들이 임상적으로 시스플라틴에 의해 유도되는 급성 신손상을 진단받는 어린 환자들에게 좀 더 효과적으로 사용될 수 있음을 보여주고 있다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• 1.1 cisplatin and nephrotoxicity 1
• 1.2 age-related nephrotoxicity 1
• 1.3 nephrotoxicity biomarkers 3
• 1.4 purpose of this study 4
• II. Materials and methods 5
• 2.1 materials 5
• 2.2 experimental design 6
• 2.3 clinical signs and body weight changes 6
• 2.4 urinalysis and serum biochemical examinations 7
• 2.5 histological evaluations 7
• 2.6 TUNEL assay 8
• 2.7 determination of urinary biomarkers 9
• 2.8 western blot analysis 10
• 2.9 RNA extraction and RT-PCR 13
• 2.10 statistical analysis 15
• III. Results 16
• 3.1 body weight change and clinical observation 16
• 3.2 comparison of serum biochemical parameters and urine analysis 16
• 3.3 histopathological examination 19
• 3,4 TUNEL assay 19
• 3.5 change in urinary biomarkers 24
• 3.6 nephrotoxicity biomarkers in the kidney tissue 24
• 3.7 urinary excretion levels of KIM-1, Netrin-1 and HMGB1 protein 32
• IV. Discussion 34
• V. Reference 41
• Abstract (in Korean) 48