Studies on the in vitro maturation and fertilization of equine oocytes : 馬における體外受精に關する硏究

국문 초록 (Abstract)

도축장유래의 난소로부터 채취된 미성숙난자는 체외에서 성숙, 수정 및 발육을 거쳐 정상적인 개체로 될 수 있음이 소를 비롯한 가축에서 입증되었다. 그러나, 말에 있어서는 연구에 필요한 말 난자의 부족과 정자의 체외수정능획득을 위한 적절한 방법이 미확립된고로 30%이하의 낮은 수정률이 보고되었으며, 체외성숙유래의 체외수정란에서 출생한 망아지의 보고는 아직까지 없으며, 현재까지 보고된 것으로는 체내에서 성숙된 난자를 이용하여 체외수정된 난으로부터 단지 1두의 망아지가 1991년에 보고되었을 뿐이다. 따라서 본 연구에서는 한정된 도축장유래의 말 난소로부터 다량의 난자를 회수하는 방법 및 회수된 난자의 체외성숙률을 조사하였으며, 또한 여러 화학물질의 정자의 체외수정능획득 유기여부를 검토하였고, micromanipulation기법으로 microfertilization의 유용성을 검토하였다.
말 난자는 주사기를 이용한 난포흡입법과 5mm 간격으로 잘게 써는 slicing을 이용하였다. 난포흡입법으로는 1개의 난소당 1.8개의 난자를, slicing으로는 4.1개의 난자를 회수하였다. 회수된 직후 난자의 핵을 검사한 결과, germinal vesicle은 난포흡입법에서 채취된 난자중에서 난구세포가 긴밀하고 세포질이 구형인 군(A)은 97%, 난구세로가 긴밀하고 세포질이 반형인 군(B)은 66%, 난구세포가 확장된 군(C)은 48%, 기타(D) 50%였다. 반면에 slicing에서 채취된 난자중에서는 A, B, C, D 순서대로 91, 80, 52, 50%였다. 따라서 A, B군을 체외성숙실험에 이용하였다. 두가지 회수방법에 의해 채취된 난자을 혈청을 함유한 TCM199배지에서 경시적으로 체외성숙률을 검토한 결과, 양군에서 16-24시간에 유의적으로 증가한 후 32시간에 가장 높은 수치를 나타냈다. 계절번식동물인 말의 계절에 따른 난소에서의 난자의 회수률을 검사한 결과, 봄에는 5.8, 여름에는 3.6, 가을에는 4.0, 겨울에는 5.1개였다. 또한 품종에 따른 난자의 회수률에는 유의적인 차이가 있었으나 연령에는 관계가 없었다. 체외성숙률은 품종, drop내의 난자수, 혈청, 가스조건등에 영향을 받지는 않았으나 도살된 후 난소의 보관시간에는 유의적인 차이가 있었다.
동결융해한 말 정자를 여러 가지 화학물질(heparin, hypotaurine, caffeine, ionophore A23187)을 이용하여 체외에서 수정능획득을 유기한 후 체외수정실험에 이용하였다. 수정시에 정자의 운동성은 10-18%였으며, 첨체반응률은 0.1μM ionophore의 1분 처리를 제외하고 40%이상이였다. 32시간 체외에서 성숙 배양한 난자를 이용하여 체외수정 실험을 한 결과, 투명대가 부착된 난자에서는 극히 낮은 수정률을 나타냈으나, 투명대를 제거한 군에서는 0.1μM ionophore의 1분처리가 가장 높은 수정률을 나타냈다. 또한 난자를 다량의 난구세포가 부착된 군, 2-3층의 난구세포가 부착된군, 난구세포를 제거한 군, 투명대를 제거한 군으로 분류하여 체외수정 실험을 한 결과, 난구세포의 양과 관계없이 투명대가 부착된 군의 체외수정률은 극히 낮았다. 말의 체외수정에 있어서 정자의 투명대 통과가 쉽게 되지 않음이 입증됐다. 따라서, microfertilization의 한방법인 투명대부분절개와 이것을 개량한 투명대부분제거의 방법을 이용하여 정자의 투명대통과의 난관을 극복하려고 시도하였다. 현미경조작의 성공률은 90%였으며, 수정률은 투명대를 부분제거한 군이 부분절개한 군에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타냈다. 투명대를 부분제거한 군의 정자침입은 배우자를 공배양후 2.5시간에 시작되었으며, 10시간에 처음으로 난자세포질에서 웅성전핵이 관찰되었다. 또한 수정란을 체외배양한 결과, 44세포까지 발육하였다. 체외수정률에 미치는 그외의 요인으로서 숫말의 개체차(3두)와 암말의 품종(2종)에 관해서 검토하였다. 숫말의 정자의 운동성은 5-17%였으며, 첨체반응률은 59-63%였으나, 수정률에는 숫말의 개체차에 따라 현저한 유의사가 있었다. 그러나, 암말의 품종에 따른 수정률에는 차이가 없었다.
이상의 결과로부터 다음과 같은 결과를 얻었다. 말의 있어서 slicing의 부족한 난자의 수를 증가시키는 효과적인 방법의 하나이며, 난포흡입법에서 채취된 난자와 동일하게 체외에서 성숙하는 능력을 가지고 있으며, 암말의 품종이 난자의 회수률에 영향을 미치고 도살후 난소의 보관시간이 체외성숙률에 미치는 요인등으로 나타났다. 또한 체외수정률이 낮은 말에서는 투명대를 부분제거함으로써 수정란을 보다 효율적으로 생산할 수 있으며, 수정률에는 숫말의 개체차가 현저한 것으로 시사됐다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter Ⅰ General introduction = 1
• Chapter Ⅱ Oocyte collection and in vitro maturation of equine oocytes = 9
• 1. Introduction = 10
• 2. Collection of cumulus-oocyte complexes by follicular aspiration and by additional slicing of ovaries = 12
• 2.1. Materials and methods = 12
• 2.1.a Oocyte collection = 12
• 2.1.b Morphological classification, fixation and staining of collected oocytes = 12
• 2.1.c Statistical analysis = 13
• 2.2. Results = 14
• 2.3. Discussion = 14
• 3. Timecourse of nuclear maturation during in vitro maturation of equine oocytes = 17
• 3.1. Materials and methods = 17
• 3.1.a Oocyte preparation = 17
• 3.1.b In vitro maturation = 17
• 3.1.c Statistical analysis = 18
• 3.2. Results = 18
• 3.3. Discussion = 18
• 4. Factors affecting the recovery of follicular oocytes and in vitro maturation = 20
• 4.1. Materials and methods = 20
• 4.1.a Oocyte preparation = 20
• 4.1.b In vitro maturation = 20
• 4.1.c Statistical analysis = 20
• 4.2. Results = 21
• 4.3. Discussion = 22
• 5. Summary = 25
• 6. Tables, figures and plates = 27
• Chapter Ⅲ In vitro fertilization of oocytes matured in vitro with spermatozoa capacitated by chemicals = 41
• 1. Introduction = 42
• 2. In vitro fertilization by stallion spermatozoa treated with various chemicals = 45
• 2.1. Materials and methods = 45
• 2.1.a In vitro maturation = 45
• 2.1.b Preparation of spermatozoa = 45
• 2.1.c Examination of sperm motility and acrosome reaction = 46
• 2.1.d In vitro fertilization = 47
• 2.1.e Statistical analysis = 48
• 2.2. Results = 48
• 2.3. Discussion = 49
• 3. In vitro fertilization capacity of cumulus cells intact, denuded ZP-intact and ZP-free oocytes = 51
• 3.1. Materials and methods = 51
• 3.1.a Preparation of oocyte = 51
• 3.1.b Preparation of spermatozoa = 51
• 3.1.c In vitro fertilization = 52
• 3.1.d Statistical analysis = 52
• 3.2. Results = 52
• 3.3. Discussion = 53
• 4. Summary = 54
• 5. Tables, figure and plates = 56
• Chapter Ⅳ In vitro fertilization of equine oocytes with micromanipulated zona pellucida = 66
• 1. Introduction = 67
• 2. Effects of partial zona dissection and partial zona removal on assisted fertilization in vitro = 69
• 2.1. Materials and methods = 69
• 2.1.a In vitro maturation = 69
• 2.1.b Micromanipulation = 69
• 2.1.c In vitro fertilization = 70
• 2.1.d Statistical analysis = 70
• 2.2. Results = 70
• 2.3. Discussion = 71
• 3. Sperm penetration and male pronucleus formation of partial zona removed equine oocytes after microfertilization = 73
• 3.1. Materials and methods = 73
• 3.1.a In vitro maturation = 73
• 3.1.b Micromanipulation = 73
• 3.1.c In vitro fertilization = 73
• 3.1.d In vitro development = 74
• 3.1.e Statistical analysis = 74
• 3.2. Results = 74
• 3.3. Discussion = 75
• 4. Effects of individual stallions and mare breeds on assisted fertilization in vitro = 77
• 4.1. Materials and methods = 77
• 4.1.a ln vitro maturation = 77
• 4.1.b Micromanipulation = 77
• 4.1.c In vitro fertilization = 77
• 4.1.d Statistical analysis = 78
• 4.2. Results = 78
• 4.3. Discussion = 78
• 5. Summary = 80
• 6. Tables, figure and plates = 82
• Chapter Ⅴ General Discussion and conclusion = 97
• 1. Oocyte collection and in vitro maturation of equine oocytes = 98
• 2. In vitro fertilization of oocytes matured in vitro with spermatozoa capacitated by chemicals = 101
• 3. In vitro fertilization of equine oocytes with micromanipulated zona pellucida = 102
• 4. Conclusion = 104
• Chapter Ⅵ General summary = 105
• Acknowledgements = 110
• References = 112