Half-life Extension of Protein Nanocages by Fusing Neonatal Fc Receptor (FcRn) Binding Domains: an advanced platform for protein nanocages-based biomedical application = FcRn 결합 도메인을 이용한 단백질 나노입자 반감기 연장 기술 개발

국문 초록 (Abstract)

(초록)
단백질 나노입자는 나노 크기의 입자 중에서도 합성 물질 대비 인체 친화성이 높고 독성이 적으며, 높은 친수성을 띤다는 점에서 소재 및 나노공학 분야에서 각광받고 있다. 또한 이러한 특성 덕분에 단백질 나노입자를 단백질 의약품으로써 활용하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나 단백질 소재는 인체 내에서 빠르게 분해되어버려 이를 실제로 약물로 활용하는데 한계를 마주하기도 한다. 이를 극복하기 위해 본 연구에서는 FcRn과 결합함으로써 lysosome에 의한 체내 단백질 분해 기작을 회피하여 인체 내 반감기를 연장할 수 있는 FcRn binding domain (FBD) 시리즈를 설계하였다. FBD를 ferritin 단백질 나노입자 외부에 발현됨으로써 ferritin이 FcRn과 결합할 수 있도록 디자인 하였고, 실제로 in vitro에서 FcRn과 FBD fusion ferritin의 결합능을 확인하였다. 또한 대장균 발현 시스템을 이용하여 합성한 FBD fusion ferritin은 높은 수득률과 구조안정성을 보여 실제 약물 전달체 및 치료용 단백질로서의 활용성 또한 뛰어날 것으로 예상된다. 이러한 FBD를 이용한 반감기 연장 솔루션은 ferritin 이외에도 다른 단백질 나노입자 및 단백질 의약품과 유전공학적으로 합성하여 사용할 수 있기에, 이를 범용적인 활용 가능성을 가진 반감기 연장 플랫폼으로 제안한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Protein based-nanocages have highly organized and homogeneous structures, high surface-area-to-volume ratios and other favorable properties, including inherent biodegradability, biocompatibility, and capacity for easy chemical and genetic modification. Therefore, they have attracted numerous research attention and have been manipulated for various applications, especially drug and vaccine delivery. Despite tremendous advances in scientific research on protein nanocages, the main hurdle for their clinical investigation is short serum half-life in the human body. In this study, a series of designed protein nanocages with expanded pharmacokinetic properties are developed by genetically conjugating neonatal Fc receptor (FcRn) binding domains (FBDs) to the surface of protein nanocages (i.e., ferritin nanocages). The FBD fused-protein nanocages (FFPNs) are successfully biosynthesized using Escherichia coli expression system. The FFPNs show FcRn binding ability in a pH-dependent manner compared to wild type of ferritin nanocages. Therefore, given the enhanced recycling properties of FFPNs, a further in vivo pharmacokinetic experiment of FFPNs could provide their potential wide use in biomedical fields. Furthermore, although ferritin nanocages are used here as a proof-of-concept, this strategy could be applied to other proteins for various applications.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 6
• 2.1. FBD series Construction, FFPNs Cloning 6
• 2.2. Transformation and Protein Expression 8
• 2.3. SDS-PAGE 8
• 2.4. Purification of Protein Nanoparticles 9
• 2.5. Protein Yield Calculation 10
• 2.6. TEM (Transmission electron microscopy) 10
• 2.7. DLS (Dynamic light scattering) 11
• 2.8. CD (Circular dichroism) 11
• 2.9. SPR (Surface plasmon resonance) 12
• 3. Results and Discussion 13
• 3.1. Construction 13
• 3.2. Expression Level and Protein Yield 19
• 3.3. Characterization 22
• 3.4. Stability (time-dependent stability) 25
• 3.5. Binding Kinetics 30
• 4. Conclusion 33
• 5. References 35
• 6. Abstract in Korean 41