Protective effect of idebenone on ethambutol-induced optic neuropathy in R28 cells and mice

국문 초록 (Abstract)

에탐부톨 시신경병증은 결핵시 복용하는 에탐부톨의 장기복용에 의해 발생하는 부작용으로 전세계적으로 매년 약 10만명의 새로운 환자가 발생하고 있는 질환이다. 에탐부톨 시신경병의 기전은 산화스트레스와 미토콘드리아의 기능 이상에 의해 생긴다고 알려져 있으며 임상양상은 미토콘드리아 DNA의 점돌연변이에 의해 발생하는 레버씨 유전성 시신경병증과 매우 유사하다. 이데베논은 코엔자임 Q10 유사체로서 레버씨 유전성 시신경병증에서 효과가 최근 임상실험에서 입증이 되어 본 연구는 에탐부톨 시신경병증에서 이데베논이 시신경 보호효과가 있을지 알아보고자 한다. 마우스의 망막신경세포로 부터 유래된 R28 세포주에 3mM의 에탐부톨을 처리하였을때 24시간 후 소포성 세포변화가 명확히 관찰이 되었으며, 이 소포성 세포변화는 이데베논 처리에 의해 감소함이 관찰이 되었다. 세포생사판별시험과 ATP양을 측정하였을때도 이데베논이 에탐부톨에 의한 독성을 줄일 수 있음을 관찰하였다. 그에 따라, 그 기전을 밝히고자 활성산소를 측정하였는데 에탐부톨만 처리한 군에서도 활성산소는 크게 증가하지 않았으며, 미토콘드리아 막전위의 변화도 없었다. Fluo-Zin3로 측정한 세포내 아연이 에탐부톨에 의해 생성된 소포내로 축적이 되는 것을 확인할 수 있었으며 lysotracker로 측정한 부위에서 이러한 소포가 라이소좀임을 확인하였다. 이러한 라이소좀으로 아연이 축적되는 과정을 이데베논이 감소시킴을 확인하였다. 마우스모델에서는 6주간 에탐부톨을 복강내 주사를 하여 확립하였으며, 실험군에는 이데베논을 oral gavage로 200mg/kg로 투여하였다. 6주 실험한 마우스의 시력변화를 측정하는 optomotor test에서 통계학적으로 유의하지는 않았으나 이데베논을 투여한 군에서는 약간의 시력호전이 있었다. 망막신경절 세포의 기능을 측정하는 망막전위도 검사의 photopic negative response에서도 역시 뚜렷한 유의한 차이는 아니지만 약간의 호전이 관찰이 되었다. 망막의 구조적인 변화는 큰 차이를 보이지 않았다. 본 연구의 결과를 미루어 보건대, 이데베논은 에탐부톨 시신경병증에서 아연의 소포체 내로의 축적을 방해하여, autophagosome lysosome complex의 결합에 의한 autophagic flux에 대한 보호효과를 보이며, 활성화 산소에 대한 효과는 없는 것으로 나타났으며, 이러한 기전으로 에탐부톨 시신경병증에 작은 시신경 보호 효과를 보인 것으로 생각한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Ethambutol is an anti-tuberculosis medication that induces retinal ganglion cell injury in the visual system. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction are widely accepted as possible pathogenic mechanisms of ethambutol-induced optic neuropathy. Idebenone, a Coenzyme Q-10 derivate, is a potent free radical scavenger with demonstrated neuroprotective effect in experimental models of Leber’s hereditary optic neuropathy, which shares common clinical features with ethambutol-induced optic neuropathy. The present study was designed to investigate whether idebenone could provide protective effect against ethambutol-induced optic neuropathy in R28 cell line and mice. The cultured R28 cell lines were pretreated with different dose of idebenone for 24h, followed by the challenge with 3mM ethambutol for 24h. Exposure of ethambutol caused the loss of cell viability and the ATP content with dose-dependent manner in R28 cell. Idebenone pretreatment had protective effect on cell survival and ATP contents in ethambutol induced neuronal death of R28 cells. However, we demonstrated that ethambutol exposure did not significantly elevate intracellular reactive oxygen species generation and mitochondria-derived superoxide production, and it had no effect on mitochondrial membrane potential. However, zinc accumulation in lysosome and microtubule associated protein 1 light chain 3 were increased with ethambutol treatment, which were efficiently attenuated by idebenone pretreatment. In mouse model, 200mg/kg ethambutol was injected intraperitoneally alternate day for 6 weeks and 200mg/kg idebenone was introduced with oral gavage. Idebenone had a slight protective effect of visual function in mouse model, which was tested by optomotor test. However, it failed to demonstrate a beneficial effect on ganglion cell structure by optical coherence tomography, and photopic negative response was not differ among groups. In conclusion, these results suggest that idebenone has a mild protective effect against ethambutol-induced neurotoxicity, and these beneficial effects of idebenone may be attributable to its roles on lysosomal zinc accumulation, not directly in preventing reactive oxygen species.