Purification and characterization of a bacteriocin produced by Bacillus amyloliquefaciens ML 361 = Bacillus amyloliquefaciens ML 361이 생산하는 박테리오신의 정제 및 특성조사

국문 초록 (Abstract)

박테리오신을 생산하는 박테리아를 김치로부터 분리하였고 16S rRNA 염기서열분석을 통해 Bacillus amyloliquefaciens로 동정되었다. 박테리오신 생산을 위한 최적배양조건은 LB(Luria-Bertani), pH 8, 37℃, 36 hr이었다. 박테리오신은 일부 그람 양성 병원성세균 특히, Bacillus cereus KCCM 11204와 Staphylococcus aureus sbsp. aureus KCCM 40050의 생장을 저해하는 것으로 확인되었다. 박테리오신의 물리화학적 특성조사를 위해 열안정성, pH안정성, 가수분해효소 내성, 유기용매 내성, detergent 내성등을 조사하였다. 박테리오신은 60℃에서 120분 까지 안정하였고, 100℃에서 60분까지 항균활성이 유지되었다. 그리고 pH 6에서 10까지 안정함을 확인하였다. 단백질가수분해효소에 의해 활성이 없어지는 것으로 보아 박테리오신은 단백질성 물질로 생각된다. 항균활성에서 박테리오신은 모든 유기용매와 detergent에 안정성을 보였다. 박테리오신의 저장성을 확인한 결과 4℃와 -20℃에서 3개월 이상 박테리오신 활성이 유지되는 것을 확인하였다. Mode of action결과, bactericidal로 확인되었고, 밥과 햄을 이용한 식품보존성 실험에서 박테리오신이 병원성 그람양성세균에 대해 저해활성을 보였다. 부분정제된 박테리오신을 농도별로 처리하여 시험균의 감수성(sensitivity)을 확인한 결과, Micrococcus luteus IAM1056이 가장 sensitivity함을 확인하였다.
박테리오신 정제는 황산암모늄 농축 후, 이온교환크로마토그래피, Sep-Pak C18와 역상 HPLC(reverse-phase high pressure liquid chromatography)에 의해 수행되었다. 박테리오신의 분자량은 Tricine SDS-PAGE로 추정하였고, MALDI-TOF mass spectrometry에 의해 3401.435 Da으로 확인되었다. 결과를 종합해보면 B. amyloliquefaciens가 생산하는 박테리오신은 생물보존제 또는 항균물질로서 사용될 수 있는 잠재력이 있다고 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• I.INTRODUCTION1
• 1.1.Study aims1
• 1.2.Bacteriocins 1
• 1.3.History1
• 1.4.Classification of bacteriocins 2
• 1.5.Biology of bacteriocins 6
• 1.6.Application of bacteriocin 7
• 1.7.Bacteriocin-producing strain 9
• II.MATERIALS AND METHODS 13
• 2.1.Isolation and characterization of bacteria 13
• 2.1.1.Morphological and biochemical characterization 13
• 2.1.2.Phylogenetic analysis by bioinformatic tool 13
• 2.1.3.Scanning electron microscopy (SEM) observation of the bacteria 14
• 2.2.Characterization of the bacteriocin 15
• 2.2.1.Determination of antibacterial activity and minimum inhibitory concentration (MIC) 15
• 2.2.2.Preparation of test plate 17
• 2.2.3.Growth condition of bacterial strain 17
• 2.2.4.Sensitivity of bacteriocin to enzymes, pH and heat treatment 18
• 2.2.5.Sensitivity of bacteriocin to organic solvents and detergents 20
• 2.2.6.Mode of action 20
• 2.2.7.Bacteriocin activity during storage 21
• 2.2.8.Food preservation test 21
• 2.3.Purification and molecular mass determination 22
• 2.3.1.CFS separation and salting out 23
• 2.3.1.1.Production of bacteriocin 23
• 2.3.1.2.Ammonium sulfate precipitation 23
• 2.3.2.Ion Exchange Chromatography (IEX) 24
• 2.3.2.1.Determination of initial condition of IEX 24
• 2.3.2.2.Anion exchange column 26
• 2.3.3.Bacteriocin purification by Sep-Pak cartridge 28
• 2.3.4.Bacteriocin purification by RP-HPLC 29
• 2.3.5.Protein quantification 29
• 2.3.6.Molecular mass determination by Tris-Tricine
• SDS-PAGE 29
• 2.3.7.MALDI-TOF mass spectrometry analyses 30
• III.RESULTS 31
• 3.1.Isolation and Characterization of bacteria 31
• 3.1.1.Morphological and biochemical characterization 31
• 3.2.Characterization of the bacteriocin 34
• 3.2.1.Determination of antibacterial activity and MIC 34
• 3.2.2.Growth condition of bacterial strain 35
• 3.2.3.Bacterial growth and antimicrobial activity at different pH condition 37
• 3.2.4.Sensitivity of bacteriocin to enzymes, pH and heat treatment 38
• 3.2.5.Sensitivity of bacteriocin to organic solvents and detergents 41
• 3.2.6.Mode of action of the bacteriocin 43
• 3.2.7.Bacteriocin activity during storage 44
• 3.2.8.Food preservation test 45
• 3.3.Purification and molecular mass determination 49
• 3.3.1.CFS separation and salting out 49
• 3.3.2.Ion Exchange Chromatography 51
• 3.3.3.Purification through Sep-Pak Cartridge 52
• 3.3.4.Purification of bacteriocin by RP-HPLC 53
• 3.3.5.Molecular mass estimation by Tris-Tricine
• SDS-PAGE 55
• 3.3.6.MALDI-TOF mass spectrometry 56
• IV.CONCLUSION 57
• ABSTRACT 59
• ACKNOWLEDGEMENT 61
• REFERENCES 63