Propolis가 抗菌, 免疫增强 및 腫瘍抑制作用에 미치는 影響 = Effects of Propolis on Antibacterial Immune Stimulating and Tumoricidal Actives

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 우리 나라에서 1995년 식품공전에 등재되어 건강보조식품으로 사용할 수 있도록 허가된 인체에 유익한 천연 물질인 propolis를 대상으로, propolis의 효과적인 추출체계에 대한 연구와 더불어 분리 추출한 propolis의 주요병원성세균에 대한 in vitro 항균효과를 분석하였으며, 더 나아가서 분리 추출한 propolis의 종양 세포주에 대한 항암작용 검색을 하였고, 이와 더불어 propolis의 면역증강효과에 미치는 in vivo 및 in vitro 영향등을 다각적으로 분석하여 propolis의 기능성 물질로서의 작용과 그 가치에 관하여 종합적으로 고찰하고자 실시하였다.
Ethanol농도가 propolis의 회수율 및 flavonoids 함량에 미치는 영향을 분석한 결과 60%이상의 ethnanol을 용매로 사용할 경우 회수율은 46.6%이었으며, ethanol의 농도가 증가하여도 회수율의 차이는 없었으나 flavonoids함량에 있어서는 80% ethanol을 사용할 때 3.41%로 가장 회수율이 높았다.
60% ethanol의 농도를 기준으로하여 여러 종류의 propolis의 회수율을 비교한 결과 생산 지역에 따른 회수율의 차이를 알 수 있었고 이와 같은 동일한 조건하에서의 회수율의 차이는 추출된 propolis내의 flavonoids 함량과 밀접한 연관성을 나타내어, 회수율이 56%로 가장 높은 폴란드산의 경우 flavonoids함량 역시 3.49%로 나타나 각 나라별 propolis 원괴에 함유된 다양한 flavonoids함량의 차이가 결국에는 회수율의 차이와 밀접한 관계가 있으며 이를 바탕으로 마련된 기준들이 결국 나라별 또한 지역별의 propolis의 가격과 품질을 결정하는 중요한 요소가 됨을 알 수 있었다.
Propolis의 주요 병원성 세균들에 대한 항균작용효과를 검색한 결과 지역별 및 flavonoids 함량에 따른 항균작용의 차이를 알 수 있었으며 특히 주목할 사항은 penicillin계 항생제인 ampiciilin의 경우 일부 세균들의 경우 내성효과를 보였으나, propolis는 오히려 항균작용을 나타내었고 또한 propolis가 Stapylcococcus aureus등과 같은 Gram 양성균에 주로 항균작용이 나타난다는 이제까지의 보고와는 달리 E. coli등과 같은 Gram 음성균에도 항균작용을 나타내는 것을 알 수 있어 이러한 항균작용의 다양성은 결국 지역적인 propolis의 차이와 연관성이 있음을 알 수 있었다.
Propolis의 종양 세포주에 대한 증식억제능력을 in vitro상에서 검색한 결과 사람의 유방암세포주, 간암세포주를 비롯한 위암세포주의 발육을 용량 의존적으로 억제함을 알 수 있었다. Propolis의 면역증강효과에 미치는 in vivo 및 in vitro 실험 결과 propolis를 8주간 급여한 생쥐에서 면역기능의 활성화와 관련이 있는 CD4^(+), CD8^(+), CD25^(+) 및 TCR의 발현이 증가되었고 염증시 발현되는 TNF-α receptor의 경우는 그 발현의 변화가 미비함을 알 수 있었다.
이에 대한 검증을 위한 in vitro상에서도 사람의 T-cell에서 CD25^(+)의 발현을 증가시켰다. 그리고 세균감염시 일차적으로 반응하는 사람의 neutrophil에 대한 propolis의 효과를 in vitro상에 검색한 결과 neutrophil의 작용을 활성화함을 알 수 있었다. 그리고 Sarcoma 180을 접종하여 인위적으로 암을 유발한 생쥐에서의 propolis 급여에 의한 항암효과를 검색한 결과 종양의 크기가 용량 의존적으로 줄어드는 경향을 보였다.
이상의 결과로 미루어 보아 propolis는 자연이 선물한 최고의 항균, 면역증강 및 항암효과를 지닌 천연 기능성물질임을 알 수 있었으며 향후 사용 목적에 따른 추출방법이나 제형의 변형 등을 통한 제품의 실용화를 통하여 국민 보건의 증진에 활용 가능성이 많음을 기대할 수 있다 하겠다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In recent, propolis has attracted much attention as an useful substance in medicine and functional food, even if it is known as a natural remedy in folk medicine since ancient times.
Propolis was registered as natural food since 1995 on Korean Food Act by Korean Food and Drug Administration(KFDA).
The present study demonstrated that the optimization of isolation of crude propolis by ethanol, antibacterial effect of propolis, tumoricidal effect and immune stimulating effect of propolis.
The results obtained were summarized as follows ;
1. In order to optimize the isolation of crude propolis, we used different concentrations of ethanol. And the extraction yield and flavonoids contents were analyzed. The optimal concentration of ethanol to separate a high quantity of propolis was 60%. but 80% ethanol is optimal for the best flavonoids extraction.
2. We compared with yield of propolis from different countries. In this study we used 60% ethanol concentration as a standard. The yield of propolis is proportional to contents of flavonoids. Namely, Polish propolis which showed the highest yield with 56% on 60% ethanol concentration revealed also the highest flavonoids content with 3.49% from all tested.
The major constituents of propolis differed from country to country. It has been suggested that the different geographyical origin influenced to the efficacy and the constituents of propolis.
3. Antibacterial activity of ethanol extracted propolis from different countries was tested against 6 microbial strains of type cultures including Gram-positive (Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae) and Gram- negative bacteria (Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris and E. coli) in vitro. Propolis extract showed anti-microbial activity against all tested bacterial strains. In addition, propolis was sensitive to E. coli which was resistant to broad spectrum antibiotics like ampicillin. These results showed that propolis may substituted for commercial antibiotics. The efficiency of anti-microbial activity of the propolis was slightly higher in 80% than 97% ethanol.
4. This study was investigated to observe the cytotoxic effect of ethanol extracted propolis against various cancer cell lines including murine lymphoma (Sarcoma-180), murine T-lymphoma (YAC-1), human breast carcinoma (MCF-7), human gastric carcinoma (KATOⅢ) and human hepatocellular carcinoma (Hep3B) and human lung adenocarcinoma (A-549) using SRB and MTT assay.
Propolis was highly effective at all treated concentration(0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 5㎍/㎖ and 25㎍/㎖). Propolis in concentration 25㎍/㎖ showed the strongest cytotoxic effect against all tested cell lines at the same concentration compared to those of untreated control group.
5. In order to determine the influence of propolis on immune function in vivo, various Doses of propolis were administered to Balb/C mice for 8 consecutive weeks. The propolis administered group showed an enhanced immune function compared to untreated control group.
Namely, the expression of CD4+, CD8+, CD25+ and TCRα/β+ cells in propolis administered group was increased but TNF-α+cells which was commonly expressed by inflammation was not affected.
And the expression of interleukin-Ⅱ receptor(CD25+) was activated in propolis administered group compare to control group. To confirm the immune modulating effect in vivo we also performed the effect of propolis on the human T cell in vitro.
The expression of IL-Ⅱ receptor(CD25+) of peripheral blood T-cell which was incubated with 50ppm propolis for 16hrs was increased with 2 fold in compare with control group.
These results suggested that long term administration of propolis modulate the immune function in vivo.
T-cell antigen receptor(TCR) is a critical role to defense the body against tumor. The expression of TCR also increased in the propolis administered group. This result indicated that propolis may use a bactericidal as well as a immune enhancing purpose for human health.
In order to determine the effect of propolis on the phagocytic activity of human neutrophil, we prepared human neutrophil from peripheral blood and co-cultured with propolis with different concentrations(10ppm, 50ppm and 100ppm, respectively) in vitro. After finishing 10 hrs and 13.5 hrs pre-incubation, neutrophil treated with 10ppm propolis showed moderately enhanced phagocytic activity(approximately 36% and 108%, respectively.). And the enhanced phagocytic activity is co-cultivation time dependent.
6. In order to investigate the curative activity of per oral administration of propolis on tumor, ICR mice was subcutaneously implanted Sarcoma 180. In 300㎎/㎏ and 600㎎/㎏ propolis administered group on day 16th, development of implanted tumors was inhibited by 40.9% and 67.9%, respectively.
In same dose of propolis administered group on day 29th, development of implanted tumors was more strongly inhibited by 51.4% and 83.59%, respectively. The regression rate of tumor was strongly dose dependent. Therefore, These data suggested propolis may show immune stimulating as well as tumoricidal effects.
In conclusion, these results indicate that propolis, one of the few natural remedies, can be use as functional food by improvement of various extraction processing and formation.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• LIST OF TABLES = ⅴ
• LIST OF FIGURES = ⅶ
• 국문초록 = ⅸ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 = 6
• 1. 실험재료 = 6
• 1.1 Propolis = 6
• 1.1.1 원료 = 6
• 1.1.2 Propolis의 조제 = 6
• 1.2 세균 균주 = 7
• 1.3 종양 세포 = 7
• 1.3.1 종양 세포주 = 7
• 1.3.2 종양세포의 배양 = 8
• 1.4 실험 동물 = 9
• 1.4.1 실험군의 설계 = 9
• 1.4.2 비장과 흉선의 추출 = 10
• 1.4.3 비장과 흉선으로부터 splenocytes와 thymocytes 분리 = 10
• 1.5 사람의 혈액으로부터 two step Percoll density gradient를 이용한 단핵백혈구(림프구) 및 호중구의 분리 = 11
• 1.6 Zymosan(항원)의 제조 = 12
• 1.7 Luminol의 제조 = 13
• 2. 실험방법 = 14
• 2.1 총 flavonoids 함량 분석 = 14
• 2.2 분리추출 propolis의 주요병원성세균에 대한 in vitro 항균 효과 검증 = 15
• 2.3 SRB assay = 15
• 2.4 MTT assay = 16
• 2.5 측정결과에 대한 분석방법 = 17
• 2.6 생쥐의 면역기능에 미치는 propolis의 in vivo 효과 = 17
• 2.6.1 Flow cytometry를 이용한 mice 면역 관련 세포군의 분포 변화 측정 = 17
• 2.7 사람의 T-림프구로부터 유리되는 Interleukin-Ⅱ 분비에 미치는 propolis의 in vitro 효과 = 18
• 2.8 Chemiluminescence 측정 = 18
• 2.9 Sarcoma 180에 의해 유발된 종양의 성장저해도 측정 = 19
• 2.9.1 종양세포의 접종 = 19
• 2.9.2 항암 스크리닝 평가 = 20
• 2.10 통계 분석 = 21
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 22
• 1. Propolis의 효과적 추출 = 22
• 1.1 Ethanol농도가 propolis의 회수율 및 flavonoids 함량에 미치는 영향 = 22
• 1.2 원산지별 proplois 회수율 비교 = 25
• 2. Propolis의 병원성세균에 대한 in vitro 항균 효과 = 27
• 2.1 각 나라별 추출 propolis의 병원성 세균에 대한 항균력 비교 = 27
• 2.2 Ethanol의 농도에 따른 propolis의 각종 세균에 대한 항균력 시험 = 32
• 3. Propolis의 종양 세포주에 대한 증식억제 효과 = 35
• 4. Propolis의 면역증강효과에 미치는 in vivo 및 in vitro 영향 = 40
• 4.1 생쥐의 면역기능에 미치는 propolis의 in vivo 효과 = 40
• 4.1.1 Propolis의 장기간 투여가 mice 비장내 T-cell 활성에 미치는 in vivo 효과 = 40
• 4.1.2 Propolis의 장기간 투여가 mice 흉선내 thymocytes 활성에 미치는 in vivo 효과 = 44
• 4.1.3 Propolis의 비장과 흉선에서 cytokine receptor인 Interleukin-Ⅱ receptor와 tumor necrosis factor-α receptor발현에 미치는 in vivo 효과 = 45
• 4.1.4 Propolis의 비장과 흉선에서 T-cell antigen receptor(TCR)의 발현에 미치는 in vivo 효과 = 47
• 4.2 Propolis의 사람 T-cell 표면의 Interleukin-Ⅱ receptor 발현에 미치는 in vitro 효과 = 48
• 4.3 Propolis 첨가 농도가 호중구의 탐식작용에 미치는 in vitro 효과 = 50
• 5. Propolis의 Sarcoma 180에 의해 유발된 종양의 성장저해에 미치는 영향 = 52
• Ⅲ. 결론 = 57
• 참고문헌 = 62
• ABSTRACT = 70