Resistance mechanism and fitness of PROTOX inhibitor-resistant transgenic rice overexpressing a Myxococcus xanthus PROTOX gene = Myxococcus xanthus PROTOX 유전자 과다발현에 의한 PROTOX 저해제 저항성 형질전환 벼의 저항성 기작과 적응성에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

PROTOX (Protoporphyrinogen oxidase) 저해 제초제는 제초제로써 많은 이상적 특성들을 지니고 있다. 즉, PROTOX 저해 제초제는 저약량 처리로도 살초효과가 뛰어나고, 환경에 있어 빠르게 분해되며, 잡초방제에 있어서도 넓은 살초범위를 지니고 있다. 하지만, 대두, 땅콩 및 당근과 같이 몇 가지 작물만이 이들 제초제들에 내성이 있는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 좁은 작물 선택성은 작물재배에 있어 PROTOX 저해 제초제의 사용을 제한한다. 만일 PROTOX 저해 제초제에 저항성 작물이 개발된다면 제초제들의 선택과 적용 시기를 더욱 더 융통성 있게 사용할 수 있을 것이며 많은 문제 잡초들을 방제할 수 있게 될 것이다.
PROTOX 저해 제초제들은 엽록소와 heme 합성 경로의 마지막 효소인 PROTOX를 저해한다. PROTOX는 2가지 동위효소가 존재하는 데, 하나는 엽록체에 위치하고 다른 하나는 미토콘드리아에 위치하고 있다. 특이하게, 부가적인 색소체 운반 서열이 없는 Myxocuccus xanthus PROTOX 유전자는 엽록체와 미토콘드리아 양쪽에 발현되었다.
이 연구에서, M. xanthus PROTOX를 발현한 8개의 형질전환 벼 계통(M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, 그리고 M8)들은 하이그로마이신에 저항성 수준을 판별하기 위하여 시험되었다. 형질전환 벼 계통 M4만이 하이그로마이신에 완전한 저항성을 보여 M. xanthus PROTOX 유전자가 T3 세대로의 유전적인 고정되었음을 알 수 있었고, 다른 형질전환 벼 계통(M1, M2, M3, M5, M6, M7, 그리고 M8)들은 불완전한 저항성을 나타냈다. 또한 형질전환 계통들 중에 벼 수량을 비교하였으나 M3, M5, M6, 그리고 M7의 수량은 비형질전환 벼와 비교하여 10-18% 감소되었다. 형질전환 계통들에서 수량감소는 주로 이삭당 영화수와 천립중의 감소에 의해 야기되었다. 무처리 조건에서 형질전환 벼의 엽록체와 미토콘드리아의 부분을 혼합하여 측정한 총 PROTOX 활성은 비형질전환 벼에서 보다 17배 더 높았었다. 비형질전환 벼에서 PROTOX 활성은 acifluorfen, oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, 그리고 oxadiazon 처리에 의해 각각 55%, 59%, 53%, 그리고 60% 저해되었다. 그렇지만, 형질전환 벼의 PROTOX 활성들은 무처리 것들과 비슷했다. PROTOX 저해 제초제인, acifluorfen, oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, 그리고 oxadiazon에 의한 형질전환 벼의 생리적 반응은 세포내 전해물질누출과 지질과산화작용에 중점을 두어 평가되었다. 처리된 모든 제초제들은 암기에서 12시간 배양한 다음 광하에 노출시켜진 비형질전환 벼의 처리된 잎 절편으로부터 세포내 전해물질이 다량 누출되었고, 세포내 전해물질은 제초제들의 농도 증대에 따라 증가되었다. 그렇지만, 형질전환 벼의 세포내 전해물질은 1,000 μM 이상의 oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, 그리고 oxadiazon 농도에서도 증가되지 않았다. 비록 형질전환 벼의 세포내 전해물질이 100과 1,000 μM acifluorfen에서 증가하였지만, 그 세포내 전해물질 누출의 크기는 비형질전환 벼보다 형질전환 벼에서 훨씬 적었다. 유사한 결과들은 지질과산화작용의 반응에서도 관찰되었다. 무처리 형질전환 벼의 Proto IX 함량은 무처리 비형질전환 벼의 것보다 약 2배 더 높았다. 벼 식물체가 제초제들에 노출되었을 때, 비형질전환 벼의 Proto IX 축적은 형질전환 벼보다 훨씬 더 높았다. 즉, 비형질전환 벼에 acifluorfen, oxadiazon, oxyfluorfen, 그리고 carfentrazone-ethyl 처리는 무처리에 비해 각각 15, 16, 20, 그리고 21배 더 높았다.
Oxyfluorfen (50 g ai ha-1) 처리에 따른 표피와 미세구조의 특징 변화를 확인하기 위한 현미경적 관찰결과, 비형질전환 벼의 처리 후 48시간에 epicuticular wax의 심한 붕괴가 관찰되었지만, 형질전환 벼에서는 관찰되지 않았다. 따라서 형질전환 벼에서 저항성을 보였던 것은 형질전환 벼가 엽록체 및 미토콘드리아 PROTOX가 과다 생성으로 인하여 PROTOX 저해 제초제에 저항성이 유도되어 Proto IX이 축적되지 않았을 것이다.
활성산소종을 소거하는 효소들이 저항성 기작에 관련되어 있는지를 구명하기 위하여, 그 저항성 수준들은 PROTOX 저해 제초제 (acifluorfen, oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, 그리고 oxadiazon)들에 노출시킨 다음에 M. xanthus PROTOX를 발현한 형질전환 벼와 비 형질전환 벼에서 항산화효소를 조사하였다. 형질전환 벼는 비형질전환 벼에 비교하여 oxyfluorfen에서 200배 이상 훨씬 큰 저항성을 지였다. 이 형질전환 벼는 또한 acifluorfen, carfentrazone-ethyl, 그리고 oxadiazon처럼 다른 PROTOX 저해 제초제들에도 교차저항성을 나타냈지만, imazapyr나 paraquat처럼 다른 작용점을 지닌 제초제에선 다중저항성은 보이지 않았다. 비형질전환 벼에 있어, 잎의 엽록소 함량은 oxadiazon 뿐만 아니라 acifluorfen, oxyfluorfen, 및 carfentrazone-ethyl에 의해서도 유의적으로 감소하였으나 형질전환 벼는 감소하지 않았다. 또한 그 PROTOX 저해 제초제들은 비형질전환 벼 잎에서 지질과산화도 야기하였다. 그러나, 형질전환 벼에서의 엽록소 함량과 MDA 생성은 PROTOX 저해 제초제들에 의하여 영향하지 않았다. 한편 비형질전환 벼는 PROTOX 저해 제초제들에 노출된 다음에 형질전환 벼보다 superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase, 그리고 glutathione reductase와 같은 항산화효소 활성들이 훨씬 높았다. 유사한 결과는 항산화 동위효소 패턴에서도 관찰되어졌다. 그럼에도 불구하고, 비형질전환 벼에서 유도된 항산화 활성은 PROTOX 저해 제초제들의 독성영향을 회복하기에 충분하지 않았다. 따라서 이들의 결과는 항산화효소들이 PROTOX 저해 제초제에 형질전환 벼의 저항성 기작과 관련이 없음을 의미한다.
형질전환 벼는 이앙 및 담수직파 벼 재배 조건에서 4가지 PROTOX 저해 제초제, acifluorfen, oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, 그리고 oxadiazon에 저항성이었다. 형질전환 벼와 비형질전환 벼는 초장과 분얼수에 있어 유사한 생육양상을 나타냈다. 그렇지만, T4와 T5 세대 형질전환 벼의 수량은 비형질전환 벼의 수량보다 7-8% 더 적었다. 형질전환 벼에서 수량 감소는 이삭당 영화수 및 천립중의 감소에 의해 야기되었다. 비형질전환 벼와 형질전환 벼 사이에 완전미, 미숙미, 그리고 피해미와 같은 미질에 있어선 차이가 없었다. 식미, 단백질, 그리고 아밀로오스 함량은 비형질전환 벼와 형질전환 벼 사이에 유사하였다. 저온피해에 있어 비형질전환 벼와 형질전환 벼 간에 차이가 없었다. 그렇지만, 형질전환 벼와 비형질전환 벼를 한발(旱魃) 스트레스에 7일 동안 노출시켰을 때, 형질전환 벼는 비형질전환 벼보다 한발에 더 내성이 있었다. 이들의 결과를 종합해 볼 때 PROTOX 저해제 저항성 형질전환 벼가 벼 재배에 있어 잡초 저항성 관리에 도움이 될 것이다. 그러나, 비형질전환 벼와 형질전환 벼 사이에 수량 차이와 한발(旱魃) 반응에 근원적인 차이에 대한 기작은 추후 연구가 요망된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Protoporphyrinogen oxidase (PROTOX)-inhibiting herbicides possess many ideal herbicidal properties; they are effective at low application dosage, rapidly degraded in the environment, and have a broad spectrum for weed control. However, only a few crops such as soybean, peanut, and cotton are known to be relatively tolerant to these herbicides. Such narrow crop selectivity limits the utility of PROTOX-inhibitor herbicides in crop culture. If crops can be made resistant to PROTOX-inhibitor herbicides, the choice and application times of the herbicides would become more flexible, and many troublesome weeds can be controlled.
PROTOX-inhibitor herbicides inhibit PROTOX, the last enzyme of the common branch of the chlorophyll- and heme-synthesis pathways. There are two isoenzymes of PROTOX, one of which is located in the chloroplasts and the other in the mitochondria. In particular, a Myxococcus xanthus PROTOX gene, without an additional plastidal transit sequence, is expressed in both the chloroplasts and mitochondria of rice.
In this study, eight transgenic rice lines (M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, and M8) expressing M. xanthus PROTOX were tested to know resistance levels to the hygromycin. The transgenic rice line M4 only was perfectly resistant to hygromycin, while other transgenic rice lines (M1, M2, M3, M5, M6, M7, and M8) showed an incomplete resistance, indicating that M. xanthus PROTOX gene was hereditaritly fixed to T3 generation. Grain yields among the transgenic lines were also compared; the yields of M3, M5, M6, and M7, were reduced by 10-18%, compared with wild type (WT). The decreased yield in the transgenic lines was mainly caused by reduction both spikelets per panicle and 1,000 grain weight. The total PROTOX activity, determined with the combined fractions of crude chloroplasts and mitochondria, of transgenic rice in nontreated control was 17-fold higher than in WT rice. PROTOX activities in the WT rice were inhibited by 55%, 59%, 53%, and 60% with acifluorfen, oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, and oxadiazon treatment, respectively. However, PROTOX activities in transgenic rice were similar to those in nontreated control. The physiological response of transgenic rice to PROTOX-inhibitor herbicides, acifluorfen, oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, and oxadiazon, was evaluated, focusing on cellular leakage and lipid peroxidation. All tested herbicides caused considerable cellular leakage from the treated leaf squares of WT rice plants upon the exposure of light following 12 h incubation in darkness. The cellular leakage increased with increasing the concentration of the herbicides. For transgenic rice, however, the cellular leakage was not increased with oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, and oxadiazon concentrations of up to 1000 μM. Although cellular leakage in transgenic rice was increased with acifluorfen 100 and 1000 μM, the magnitude of the cellular leakage was much lower in transgenic rice than in WT. Similar results were observed for the response of lipid peroxidation to herbicides. The Proto Ⅸ content of nontreated transgenic rice was about 2-fold greater than that of the nontreated WT. When rice plants were exposed to herbicides, however, the accumulation of Proto IX in WT was much more greater than in transgenic rice; it was a 15, 16, 20, and 21-fold higher in WT with acifluorfen, oxadiazon, oxyfluorfen, and carfentrazone-ethyl treatment, respectively, compared with nontreated control.
With oxyfluorfen (50 g ai ha-1) treatment, to confirm the changes of epidermal and ultrastructural features, microscopic observation was conducted. In WT, serious damage was observed in epicuticular wax at 48 h after treatment (HAT), but not for transgenic rice. These results suggest that the transgenic rice did not accumulate Proto IX, probably due to overproduction of chloroplastic and mitichondrial PROTOX, leading to resistance to PROTOX-inhibiting herbicides.
To investigate whether active oxygen species-scavenging enzymes are involved in the resistance mechanism, the levels of resistance were quantified on the transgenic rice plants expressing M. xanthus PROTOX when exposed to PROTOX-inhibiting herbicides (i.e. acifluorfen, oxyfluorfen, carfentrazone-ethyl, and oxadiazon). The transgenic rice had greater resistance more than 200-fold to oxyfluorfen, compared with WT rice plants. This transgenic rice also showed a cross-resistance to other PROTOX-inhibiting herbicides like acifluorfen, carfentrazone-ethyl and oxadiazon, though did not show a multi-resistance to herbicides with different target sites such as imazapyr and paraquat. In WT rice, leaf chlorophyll content was significantly reduced by acifluorfen, oxyfluorfen, and carfentrazone-ethyl as well as by oxadiazon, but not in transgenic rice. Also, the PROTOX-inhibiting herbicides caused a significant lipid peroxidation in WT rice leaves. In transgenic rice, however, the MDA production was not affected by PROTOX-inhibiting herbicides. In addition, the WT rice had greater antioxidant enzyme activities like superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase, and glutathione reductase than transgenic rice, when exposed to PROTOX-inhibiting herbicides. Similar result, in terms of antioxidant isozyme profiles, was observed. Nevertheless, the induced antioxidant activity in WT rice was not enough to overcome a toxic effect of PROTOX-inhibitor herbicides. Inversely, therefore, these results suggest that the antioxidative enzymes were not involved in the resistance mechanism of transgenic rice to PROTOX-inhibiting herbicides.
The transgenic rice was resistant to five PROTOX inhibitors, oxyfluorfen, acifluorfen, carfentrazone-ethyl, and oxadiazon in the transplanted and direct-seeded rice culture. The transgenic and WT rice exhibited similar growth behavior, in terms of plant height and number of tillers. However, the grain yield of T4 and T5 transgenic rice was 7-8% less than that of WT. The reduction of yield in the transgenic rice was caused by reduced number of spikelets per panicle and 1,000 grain weight. There were no differences in qualities of milled rice such as head rice, immature rice, and damaged kernel between WT and transgenic rice. The palatability, protein, and amylose contents were similar between WT and transgenic rice. It turned out that there was no difference in chilling injury between WT and transgenic rice. However, when transgenic and WT rice plants were exposed to drought-stress for 7 d, transgenic rice was more tolerant to drought than WT. These results indicate that PROTOX inhibitor-resistant transgenic rice will help in weed resistance management in rice culture. However, more research is required to elucidate the mechanisms underlying the slight yield difference and differential drought response between WT and transgenic rice.

목차 (Table of Contents)

• Abstract = 13
• Chapter Ⅰ General Introduction = 17
• General Introduction = 18
• Chapter Ⅱ Resistance Mechanisms of PROTOX Inhibitor-Resistant Transgenic Rice = 27
• Introduction = 28
• Materials and Methods = 30
• Result and Discussion = 36
• Chapter Ⅲ Resistance Pattern and Antioxidant Enzyme Profiles of PROTOX Inhibitor-Resistant Transgenic Rice = 51
• Introduction = 52
• Materials and Methods = 54
• Result and Discussion = 59
• Chapter Ⅳ Resistance Levels and Fitness of PROTOX Inhibitor-Resistant Transgenic Rice in Paddy Fields = 80
• Introduction = 81
• Materials and Methods = 83
• Result and Discussion = 87
• References = 103
• 초록 = 115