Effects of hyaluronic acid and polynucleotide on outgrowth of human trophoblastic spheroids

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Successful implantation for pregnancy requires precise coordination between the embryo and endometrium. The roles of some macromolecules are prominently emphasized in human in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) program, as failures in attachment or migration within the endometrium can lead to unsuccessful implantation. Hyaluronic acids (HA) have been shown to aid embryo implantation, while polynucleotides (PN) promote cell proliferation and aid in wound healing. Based on these finding, this has led to their utilization in various fields for regenerative and anti- inflammatory therapies. This study aimed to investigate the single and synergistic effects of HA and PN on promoting migration and outgrowth using human trophoblastic JAr cells. Cell migration assay was conducted to evaluate promoting effects of HA and PN treatment on early events of trophoblasts implantation. The relative number of migrated cells were significantly higher the HA+PN treatment than other groups. The JAr cells were used to form spheroids that mimic the implantation process of trophoblasts in vitro. After treatment of HA, PN and HA+PN for 48 hr, a significant increase in the outgrowth area was observed in the HA+PN compared to other groups. In western blot analysis, proteins expression of LIF and β-actin were significantly higher the HA+PN treatment than other groups. In conclusion, this study demonstrated the outgrowth promoting effect of trophoblastic spheroids with HA+PN treatment rather than with HA or PN alone. These results firstly found that synergistic effects on integrins and cytoskeletons expressions in trophoblastic cells when HA+PN treated together. The increase of outgrowth area may be related to the improvement in the implantation process of blastocysts in ET media. It is planning to develop a new ET medium to promote of the implantation and pregnancy rate in human IVF-ET program.

국문 초록 (Abstract)

난임을 극복하기 위한 인간의 체외수정 및 배아이식술(human IVF-ET)은 과배란을 위한 난포 자극, 난자 회수, 체외수정, 배아 체외배양 등 여러 단계를 거쳐 배아 이식으로 마무리된다. 이러한 과정에서 일부 생체 고분자들의 역할이 배아 배양과 착상에서 중요하게 강조되고 있다. 고분자 다당류의 일종인 히알루론산 (hyaluronic acid, HA)이 함유된 배양액으로 배아 이식을 시행한 경우 배아 착상율을 향상시킬 수 있다는 여러 연구가 보고되었다. 폴리 뉴클레오타이드 (polynucleotide, PN)는 세포 증식을 촉진하고, 상처 치유에 도움이 되는 것으로 밝혀져, 이를 기반으로 다양한 분야에서 활용되고 있다. 본 연구에서는 HA과 PN를 함께 사용했을 때 나타날 수 있는 착상 촉진 상승 효과를 확인하기 위해 영양배엽성 JAr 세포를 이용해 실험을 진행하였다. 세포 이동 분석으로 세포 이동능을 비교해 보았을 때, HA+PN의 상대적인 이동 세포 수가 통계적으로 유의하게 높은 것으로 나타났다(P < 0.05). 이후 체외 착상 모델을 모방한 3차원 배양 스페로이드를 만들어 실험을 진행하였으며, HA와 PN 그리고 HA+PN의 외향성장 촉진 효과를 비교해 보았을 때, HA+PN의 상대적인 외향성장 면적이 타 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 증가된 것을 확인하였다(P < 0.05). 착상 관련 유전자들의 mRNA 발현 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과, HA+PN 처리 시 세포 부착분자 중에서는 ITGαV와 ITGβ3, 그리고 세포골격 유전자들의 발현이 다른 그룹에 비해 높게 나타났으나 통계적으로 유의하지 않았다. Western blot을 이용한 단백질 변화 확인 시 HA+PN 처리 그룹에서 사이토카인(LIF) 과 세포 골격 단백질(β-actin) 의 발현이 통계적으로 유의하게 높게 나타남을 확인할 수 있었다(P < 0.05). 결론적으로 이 연구를 통해 HA+PN을 처리한 경우에 영양배엽 스페로이드의 외향성장 상승 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 외향성장 상승 효과는 이식된 포배의 착상률 향상 효과와 관련이 있을 것으로 생각되며, 이를 활용하여 배아이식용 배양액을 개발하는 것을 진행하고자 한다. 그러나, HA와 PN이 상승 효과를 나타내는 기작은 명확하게 밝혀지지 않아 이에 대한 연구와 영양배엽 스페로이드의 한계를 극복할 수 있는 포배기 배아를 이용한 추가적인 실험이 필요할 것으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT = i
• TABLE OF CONTENTS = iv
• LIST OF TABLES = vi
• LIST OF FIGURES = vii
• Ⅰ. INTRODUCTION = 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 4
• 1. Culture of trophoblastic JAr cells = 4
• 2. Formation of trophoblastic spheroids = 4
• 3. Cell viability and cytotoxicity assay = 5
• 4. Transwell cell migration assay = 6
• 5. Evaluation of outgrowth of JAr cell spheroids with HA, PN and HA+PN = 7
• 6. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis = 8
• 7. Western blot analysis = 10
• 8. Statistical analysis = 11
• Ⅲ. RESULTS = 12
• Ⅳ. DISCUSSION = 33
• Ⅴ. CONCLUSION = 39
• REFERENCES = 40
• 국문 요지 = 49