Biochemical characterizations of stress associated proteins from arabidopsis thaliana (AtSAPs) and the potential interaction between Doa1 and Hse1 in intracellular trafficking

국문 초록 (Abstract)

Arabidopsis thaliana의 SAP gene family는 14개의 member로 구성되어있다. 14개의 멤버들 중 10개, AtSAP1-10은 N –말단 부분에는 A20 znic finger 도메인이 존재하며 C-말단 부분에는 AN1 zinc finger 도메인을 가지고 있다. A20 zinc finger 도메인은 NF-κB 신호체계를 하향 조절 하는TNF-α 유도 단백질 A20의 한 부분으로 처음 규명 되었다. 이후에 A20 zinc finger 도메인은 ubiquitin을 인식하고 E3 ubiquitin ligase 활성을 갖는다고 밝혀졌다. AN1 zinc finger 도메인은 Xenopus laevis 의 ubiquitin-like 단백질인 ZNF216에서 처음 발견되었으나 생물학적 기능은 거의 알려져 있지 않다. 특히 동물에서 A20/AN1 zinc finger 도메인을 갖는 단백질은 면역체계를 조절하는 역할을 한다고 알려져 있다. 하지만 식물체 내에서 A20/AN1 zinc finger를 갖는 단백질 경우 신호전달 시스템이 거의 연구가 진행되어지지 않았다. 그래서 이 논문을 통해 AtSAP family 들이 동물에서와 마찬가지로 ubiquitin을 인지하고 E3 ubiquitin ligase 활성을 갖는지 AtSAP5를 통해 확인한 결과를 보고하려고 한다. 연구 결과, AtSAP들은 적어도 3가지 형태의 poly-ubiquitin 사슬 (linear, K-48 linked, K63-linked) 을 인식할 수 있었다. 그리고 AtSAP5는 AtUBC4를 E2 conjugating enzyme 으로 사용하여 E3 ubiquitin ligase 활성이 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해서 식물체 내에서 AtSAP들이 ubiquitin을 매개로 하여 세포신호 조절을 할 수 있을 것이라고 판단된다.
Yeast Doa1/Ufd3는 endoplasmic reticulum-associated protein degradatio n (ERAD) 와 endosomal sorting 에 관여하는 단백질이다. Doa1의 endosomal sorting 은 Hse1과 상호작용하여 일어난다. 이전의 연구결과에서 Doa1과 Hse1의 상호 작용은 Doa1의 PFU도메인과 Hse1의 SH3 도메인 직접적으로 매개되어 endosomal sorting이 일어난다고 보고 되었다. 하지만 Doa1과 Hse1의 직접적 상호작용인지는 확실하지 않다. 그래서 GST-pulldown assay, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) 와 nuclear magnetic resonance (NMR).을 통해서 Doa1와 Hse1의 연관성을 연구하였다. GST-pulldown assay결과 두 단백질이 직접적인 상호작용을 확인할 수 없었다. FCS통한 실험을 통해서 autocorrelation 확인해 보았지만 Doa1과 Hse1의 직접적인 상호작용을 확인 할 수 없었다. 마지막으로 ~mM 정도 약한 결합력으로 두 단백질 간의 상호 작용이 있는지 NMR을 통해 확인 보았지만 어떠한 아미노산의 위치 변화도 확인 할 수 없었다. 이러한 결과로 Doa1과 Hse1 관여하는 endosomal sorting이 일어나기 위해서는 두 단백질 사이에 알려지지 않은 다른 매개체 역할을 하는 단백질이 있을 것이라고 추측할 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Arabidopsis SAP gene family consists of 14 members. The 10 of 14 members (AtSAP1~AtSAP10) have two zinc finger domains: A20 zinc finger domain at the N-terminus and AN1 zinc finger domain at the C-terminus. A20 zinc finger domain was first identified as a part of TNF-α inducible protein A20 which is required for the down-regulation of NF-κB. The A20 zinc finger domain binds ubiquitin and possesses an E3 ubiquitin ligase activity. AN1 zinc finger domain is first found in an ubiquitn-like protein from Xenopus laevis but its biological function remains unresolved. In animals, the role of A20/AN1 zinc finger-containing proteins in regulating immune responses has been well characterized, including ZNF216 and AWP. However, the regulatory targets and modes of action of such proteins including AtSAPs in plants are largely unknown. Here I investigated whether recombinant AtSAPs recognize poly-ubiquitin chains and AtSAP5 possesses E3 ubiquitin ligase activity in vitro like their mammalian homologues. I found that AtSAPs recognize at least three types of linkage-specific poly-ubiquitin chains: linear, K48-linked and K63-linked ones. Also, I observed that AtSAP5 exhibits an E3 ubiquitin ligase activity with AtUBC4 as its cognate E2 in vitro. My results suggest that AtSAPs may be involved in ubiquitin-mediated cellular processes in plants.
Yeast Doa1/Ufd3 is involved in endoplasmic reticulum-associated protein degradation and endosomal sorting. Doa1 functions in the endosomal sorting by its association with Hse1. The association of Doa1 with Hse1 was previously reported to be mediated between PFU domain of Doa1 and SH3 of Hse1, but it remains unclear whether the association between Doa1 and Hse1 is direct. Here I found that Doa1 and Hse1 do not interact directly in vitro by combination of pulldown, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and nuclear magnetic resonance (NMR). No interaction was found in the pulldown assay at the molar ratio of 25. FCS data showed no shift in autocorrelation functions compared to a known interaction with ~ 10 µM Kd. NMR titration revealed subtle changes in some peak positions presumably due to line broadening. My results suggest that the association between Doa1 and Hse1 is likely to be mediated by an unknown protein in vivo.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Biochemical characterizations of stress associated protein from Arabidopsis thaliana (AtSAPs) 1
• I. Introduction 2
• II. Materials and methods 4
• III. Results 6
• IV. Discussion 26
• V. References 27
• Chapter 2. Biochemical studies on the potential interaction between Doa1 and Hse1 in intracellular trafficking 30
• I. Introduction 31
• II. Materials and Methods 33
• III. Results 39
• IV. Discussion 51
• V. References 53
• Appendix 56