5s rRNA 염기서열 분석을 통한 소나무재선충과 어리소나무재선충의 특이적 Real-Time PCR 유전자탐침 개발

국문 초록 (Abstract)

소나무재선충병은 우리나라 소나무림에서 가장 문제가 되고 있는 중요한 소나무 병으로 솔수염하늘소(Monochamus alternatus)에 의하여 매개되는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)이 병원체이다. 그러나 우리나라 소나무 고사목에서는 어리소나무재선충(Bursaphelenchus mucronatus)도 많이 발견되고 있다. 두 선충은 형태적으로 구분하기가 용이하지 않다. 따라서 본 논문은 소나무재선충과 어리소나무재선충을 신속하고 정확하게 분류, 동정하기 위하여 Real-time PCR 분석방법을 이용하였다. 소나무재선충은 경북 포항, 구미, 영덕의 소나무재선충 피해 고사목에서, 어리소나무재선충은 경북 청도, 고령, 경산의 소나무 고사목에서 분리하였다. 그리고 순수 계대배양한 선충에서 DNA를 추출하였고 date base를 이용하여 소나무재선충과 어리소나무재선충의 5s rRNA 지역의 염기서열을 비교·분석한 결과, 국내에서 분리된 소나무재선충과 어리소나무재선충은 각각 서로 동일한 5S rRNA염기서열을 보유하였으며, 소나무재선충은 531bp였고 어리소나무재선충은 564bp였다.
이것을 바탕으로 종 특이적 primer/probe도 설계하였다. 염기서열분석을 위해서 고안된 유전자 탐침은 각각의 소나무재선충과 어리소나무재선충의 5s rRNA를 특이적으로 증폭시켰다. 이는 고안된 유전자 탐침만으로도 이들 두 종을 특이적으로 구별할 수 있음을 확인시켜 주게 되었다. Real-time PCR을 이용한 분석은 두 종에 각각 비특이적인 유전자 증폭없이 특이적인 반응만을 유도하는 우수한 유전자 탐침임을 증명하였다.
그리고 설계된 primer와 probe를 이용하여 Real-time PCR에서 특이도 및 민감도 확인 결과 0.2ng까지 분석이 가능하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The pine wilt disease is one of the most serious and destructive diseases in many pine forests of Korea. The causal agent of this disease is pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus transmitted mainly by the vector, pine sawyer Monochamus alternatus. Close species B. mucronatus is also frequently detected from dead pine trees. These two species are not easy to distinguish the differences because of similarities in their morphological characters and life cycles. Therefore, this study was carried out to classify and identify those two species efficiently and accurately using the real-time species-specific PCR analysis.
Isolates of B. xylophilus were obtained from the infected dead pine trees from Pohang, Gumi and Youngduk and those of B. mucronatus were from Chungdo, Goryung and Kyungsan in Gyungbuk province, respectively.
Extraction of DNA was performed from each species with pure subculture. Then, sequence analysis in the region of 5s rRNA of B. xylophilus and B. mucronatus was conducted and compared to the sequences of data base. In consequence, the isolated nematode species was completely identical sequences in the region of 5s rRNA. The size of 5S rRNA was 531 bp for B. xylophilus and 564 bp for B. mucronatus, respectively. Based on the sequence analysis, the species-specific PCR primer/probe was designed. The primer/probe was used for the specific amplification of 5s rRNA of both species. The species-specific differencds of both species were able to be detected with developed primer/probe in this study.
It was also confirmed that the real-time species-specific PCR analysis was an efficient and potential method to induce the specific reaction of genes without any non-species specific DNA amplification of both species.
There was possibility that real-time species-specific PCR analysis might detect limit of species-specificity and sensitivity to 0.2 ng using designed primer/probe in the study.

목차 (Table of Contents)

• 서 론 3
• 재료 및 방법 5
• 1.피해 고사목 5
• 2.선충 분리, 동정 및 배양 5
• 3.DNA 추출 5
• 4.염기서열 분석 및 PCR 반응 조건 8
• 결과 및 고찰 9
• 1.소나무재선충과 어리소나무재선충의 염기서열 분석 9
• 2.염기서열 비교 분석 및 specific primer 와 probe 설계 12
• 3.Real-time PCR을 이용한 specific primer / probe 확인 15
• 적 요 18
• 참고문헌 19