分子生物學的 方法을 利用한 生物膜 下水處理 工程의 微生物 群集 解釋 = Microbial community analysis for the biofilm wastewater treatment process using the molecular biological techniques

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The biofilm process differs from the activated sludge process in that the latter operates with the activated biomass suspended in the system while it attaches to the carriers in the biofilm process, which means that biomass grows and adheres to the surface of the carriers. Recently, the concerns on biofilm process are increasing because of its high nitrification efficiency and the convenience of operation.
To characterize nitrifying bacterial communities, the routine bacteriological enumeration by spread-plate or most-probable-number count, has been studied. However, these methods are not suitable because these need some weeks of incubation before these bacteria are enumerated, as well as these techniques often detect only a minor portion of biofilm that may increase the statistical uncertainty of the enumerations. Thus, better monitoring of the content of bacteria in the microbial community, polymerase chain reaction (PCR)-based techniques, such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and cloning, fluorescence in situ hybridization (FISH) and INT-dehydrogenase activity (DHA) test have been utilized and proven as an effective method for analysis of microcolonies and biofilm without the need for disruptive or labour consuming procedures
In this study, to assess the effect of DO concentration andtemperature in aerobic biofilm reactor, the combination of PCR-based techniques, such as DGGE and cloning, FISH and INT-DHA test was used in this study. And for the purpose of evaluating the independent anoxic reactor, the pilot-scale upflow Biobead? process, one of the biological aerated filters (BAF), was set up. To study the community of the denitrifying microorganisms, PCR-DGGE was performed.
To assess the effect of DO concentration in aerobic biofilm reactor, four reactors with different DO concentrations (1, 3, 5 and 7 mg/L, respectively) were set up in the thermostat and acclimated. The optimal DO concentration with stable nitrification efficiency in aerobic biofilm reactor was above 5.0 mg/L. Low DO concentration led the the growth of filamentous microorganism such as type 021N. The results of DGGE and cloning based on PCR targeting 16S rRNA and amoA gene showed that the community of ammonia oxidizing bacteria (AOB) and the ratio of Nitrosomonas sp. changed little in spite of different nitrification efficiencies. And the result of FISH showed that higher DO concentration led the increase of AOB and nitrite-oxidizing bacteria (NOB) ratios and the decrease of heterotrophs ratio. The INT-DHA showed that only active biomass influenced the nitrification efficiency.
To assess the effect of temperature in aerobic biofilm reactor, three reactors with different temperature (5, 10 and 30℃, respectively) were set up in the thermostat and acclimated. Nitrification efficiency was sharply decreased at low temperature, whereas a little COD removal efficiency was decreased. The results of DGGE and cloning based on PCR targeting 16S rRNA and amoA gene showed that the ratio of Nitrosomonas sp. increased as temperature was increased. So, it was estimated that different temperature changed the community of microorganisms. And the result of FISH showed that lower temperature condition led the decrease of AOB and NOB. As temperature was decreased, the INT-DHA and the attached biomass was decreased.
To assess the independent anoxic reactor of the modified upflow Biobead? process which was used commercially, PCR-DGGE was performed. Two types of nitrite reductase genes were selected. One is nirS represented cytocrome cd1 nitrite reductase gene and the other is nirK represented Cu-containing nitrite reductase gene. Denitrifier community in the independent anoxic reactor was analyzed with PCR-DGGE using these two denitrifying functional genes.
As the result of the PCR, only nirS gene was detected between nirS and nirK. With the result of the DGGE, specific bands became strong, as the operating days were longer, nitrate loading rate was increased. otherwise those of the initial activated sludge showed various bands. In the consequence of the sequence of the DGGE bands, various denitrifiers were sequenced in the initial activated sludge, while specific denitrifiers like Alcaligenes faecalis were predominant in the anoxic reactor. Consequently, introduction of the independent anoxic reactor made it possible to achieve 96% denitrification efficiency, and was proper for the modification of BAF process.
The molecular biological techniques give us the fundamental knowledge of microbial community. These method will be useful for the design of the aerobic biofilm reactor and the operational diagnosis method for the wastewater treatment plant.

국문 초록 (Abstract)

활성슬러지 공정은 침전조가 필요하기 때문에 높은 수준의 유지관리 기술과 잉여슬러지가 많은 단점이 있다. 반면, 생물막을 이용한 하수처리 공정은 반응기내 미생물을 생물막에 부착시켜 유지시킴에 따라 침전조가 필요 없어 유지관리가 용이하고 잉여슬러지가 거의 발생하지 않는 장점을 가진다. 이러한 생물막 하수처리 공정의 미생물 군집에 대한 해석을 본 논문에서는 최신의 분자생물학적 기술인 PCR, DGGE, cloning, FISH법을 이용해 해석하였다. 또한 외부 환경인자가 미치는 영향을 해석하기 위해, 각기 다른 DO, 온도를 가지는 반응기를 운전하였고, INT-DHA법을 통하여 활성도를 해석하였다.
각각 다른 DO로 운전되는 호기성 생물막 반응기에서는 AOB 중의 유사한 Nitrosomonas 속의 분포비(cloning 결과), eubacteria에 대한 AOB 분포비 증가(FISH결과), Nitrosomonas 속의 상대활성분율 증가(INT-DHA결과)가 높은 DO에서의 질산화 효율 증대에 영향을 미친 것으로 나타났다. 갑작스런 질산화 효율의 저하를 AOB 분포비의 감소(FISH결과)를 통해 확인할 수 있었기 때문에 FISH가 효율적인 운전진단인자로 판단된다. 또한 각각 다른 온도로 운전되는 호기성 생물막 반응기에서는 AOB 중의 Nitrosomonas 속 분포비의 감소(cloning결과), eubacteria에 대한 AOB 분포비 감소(FISH결과), Nitrosomonas 속의 상대활성분율 감소(INT-DHA결과) 및 부착미생물량의 감소가 낮은 온도에서의 질산화 효율 저해에 영향을 미친 것으로 나타났다. 특히, AmoA primer를 통해서만 Nitrosospira 속을 검출할 수 있었는데, AOB의 군집 특성 해석을 위해서는 CTO primer보다 AmoA primer가 더 적절한 것으로 판단된다. 독립적인 무산소조가 modified BAF 공정의 탈질 기능 강화를 위해 도입되어, 탈질미생물 군집의 특성을 조사하였다. 독립적인 무산소조 내에서는 alcaligenes faecalis 등의 특정 탈질미생물이 우점화 되어 탈질을 수행함을 확인하였고, 하수처리 공정내의 주된 탈질미생물의 군집해석은 nirS 유전자를 통해 수행함이 적절한 것으로 나타났다.
본 연구에서는 PCR, DGGE, cloning, FISH법 등의 분자생물학적 기술이 생물학적 하수처리 공정의 해석에 의미 있는 결과를 제공하였다. 향후, 이러한 분자생물학적 미생물 해석기법을 하수처리장의 운전진단 기법으로 발전시키면 처리수질 향상에 기여할 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ 서론 = 1
• 1.1 연구의 필요성 = 1
• 1.2 연구 목적 = 3
• Ⅱ 문헌고찰 = 4
• 2.1 생물학적 질산화 = 4
• 2.1.1 기본 이론 = 4
• 2.1.2 질산화 미생물 = 6
• 2.1.3 질산화의 영향인자 = 8
• 2.2 생물학적 탈질 = 12
• 2.2.1 기본 이론 = 12
• 2.2.2 탈질미생물 = 18
• 2.2.3 탈질의 영향인자 = 21
• 2.2.4 탈질 공정 = 24
• 2.3 생물막 = 27
• 2.3.1 생물막의 형성과 특징 = 27
• 2.3.2 생물막의 구조 = 31
• 2.3.3 생물막 형성의 영향인자 = 32
• 2.3.4 생물막의 종류와 지표 미생물 = 32
• 2.4 분자생물학적 방법에 의한 미생물 군집 해석 = 34
• 2.4.1 DNA 및 RNA의 구조와 기능 = 37
• 2.4.2 암모니아 산화 미생물의 16S rRNA 및 특정효소 = 41
• 2.4.3 Polymerase Chain Reaction = 45
• 2.4.4 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis = 47
• 2.4.5 Cloning = 51
• 2.4.6 Fluorescence in situ hybridization = 53
• 2.4.7 INT-dehydrogenase activity = 56
• Ⅲ 호기성 생물막 반응기에서 용존산소 변화에 따른 질산화 미생물 군집의 특성 = 59
• 3.1 서론 = 59
• 3.2 실험재료 및 방법 = 62
• 3.2.1 호기성 생물막 반응기 = 62
• 3.2.2 유입수의 성상 및 운전조건 = 63
• 3.2.3 수질분석방법 = 65
• 3.2.4 DNA 추출 및 중합효소연쇄반응 = 65
• 3.2.5 DGGE = 69
• 3.2.6 Cloning = 69
• 3.2.7 DGGE band 및 colony의 염기서열 분석 = 70
• 3.2.8 Fluorescence in situ hybridization = 71
• 3.2.9 부착 미생물량 측정 = 74
• 3.2.10 미생물 활성도 = 74
• 3.3 결과 및 고찰 = 77
• 3.3.1 호기성 생물막 반응기의 운전결과 = 77
• 3.3.2 호기성 생물막 반응기의 AOB 군집 분석 = 82
• 3.3.3 FISH법에 의한 질산화 미생물의 분포 = 88
• 3.3.4 INT-DHA에 의한 질산화 미생물의 활성도 = 98
• 3.4 중간 결론 = 101
• Ⅳ 호기성 생물막 반응기에서 온도 변화에 따른 질산화 미생물 군집의 특성 = 103
• 4.1 서론 = 103
• 4.2 실험재료 및 방법 = 105
• 4.2.1 호기성 생물막 반응기 = 105
• 4.2.2 유입수의 성상 및 운전조건 = 106
• 4.2.3 수질분석방법 = 108
• 4.2.4 DNA 추출 및 중합효소연쇄반응 = 108
• 4.2.5 DGGE = 112
• 4.2.6 Cloning = 112
• 4.2.7 DGGE band 및 colony의 염기서열 분석 = 113
• 4.2.8 Fluorescence in situ hybridization = 114
• 4.2.9 부착 미생물량 측정 = 117
• 4.2.10 미생물 활성도 = 117
• 4.3 결과 및 고찰 = 120
• 4.3.1 호기성 생물막 반응기의 운전결과 = 120
• 4.3.2 호기성 생물막 반응기의 AOB 군집 분석 = 124
• 4.3.3 FISH법에 의한 질산화 미생물의 분포 = 128
• 4.3.4 INT-DHA에 의한 질산화 미생물의 활성도 = 136
• 4.4 중간 결론 = 139
• Ⅴ Modified BAF 공정을 이용한 독립적인 무산소조의 탈질미생물 군집의 특성 = 140
• 5.1 서론 = 140
• 5.2 실험재료 및 방법 = 142
• 5.2.1 Modified BAF 공정 운전 = 142
• 5.2.2 수질분석방법 = 144
• 5.2.3 DNA 추출 및 중합효소연쇄반응 = 144
• 5.2.4 DGGE 및 염기서열분석 = 147
• 5.2.5 Accession Numbers = 147
• 5.3 결과 및 고찰 = 148
• 5.3.1 전탈질 반응조의 운전결과 = 148
• 5.3.2 PCR 결과 = 149
• 5.3.3 cd1-type nitrite reductase gene의 DGGE profile = 151
• 5.3.4 미생물 군집의 염기서열 분석결과 = 152
• 5.4 중간 결론 = 154
• Ⅵ 결론 = 155
• 참고문헌 = 159
• ABSTRACT = 175