세포기반시험법을 이용한 약물상호작용 평가 연구 = A study on drug interaction evaluation using cell-based assay

국문 초록 (Abstract)

오늘날 인구의 고령화와 만성질환의 증가로 약물의 다제병용이 증가하였으며, 이에 따라 약물의 개발과정 및 임상적용에 있어서 약물상호작용평가의 중요성이 증대되었다. 약물의 대사는 대부분 간에서 일어나며, 그 중 CYP450 동질효소에 의한 대사가 주를 차지한다. 위와 같은 이유로, 현재 세계 각국의 규제기관에서는 신약개발과정에 있어서 약물상호작용연구에 관한 가이드라인을 마련하고 있다. 현재까지 시험관계 약물상호작용연구에서, 특히 CYP효소의 유도수준의 측정은 효소활성측정법이 우수한 방법으로 고려되었으나, 최근에는 높은 민감도를 갖는 mRNA발현측정법과 단백질발현측정법이 효소활성측정법을 대체하는 방법으로 고려되고 있다. 본 연구에서는 LC/MS/MS를 이용한 효소활성측정법을 qRT-PCR을 이용한 유전자발현측정법과 western blot을 이용한 단백질발현측정법을 이용하여 비교하였으며, 이와 같은 연구목표를 달성하기 위하여, HepG2, Hep3B, HepaRG 및 사람일차간세포와 같은 다양한 세포를 이용하여 효소활성측정법과 유전자 발현측정법 및 단백질발현측정법을 확립하였다. 기존의 연구결과를 바탕으로, 많은 CYP450 동질효소중에 약물대사에 주로 관여하는 CYP3A4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19을 평가효소로 선택하였으며, 이 4종의 CYP 동질효소의 유도수준을 LC/MS/MS를 이용한 효소활성측정과 qRT-PCR을 이용한 mRNA발현수준 및 western blot을 이용한 단백질 발현수준으로 분석하였다. 그 결과, mRNA 발현수준을 측정하여 CYP 동질효소의 유도수준을 평가하는 방법이 LC/MS/MS를 이용하여 측정하는 방법보다 더 감도가 높은 방법이라는 것이 입증되었다. 그러나, 측정결과의 변동성이 큰 이유로, 단독으로 효소활성측정법을 대체하여 사용하기는 곤란한 것으로 판단되며, Western blot을 이용한 단백질발현수준을 측정하는 방법은 본 연구에서는 신뢰할 만한 결과를 보여주지 못하였다. 이과 같은 결과를 바탕으로, CYP450 효소의 유도연구에서 qRT-PCR을 이용한 mRNA발현측정법은 LC/MS/MS를 보완할 수 있는 부가적인 측정법으로 활용될 수 있으며, 이는 신약개발의 초기단계에서 약물상호작용을 보다 효율적으로 스크리닝할 수 있는 대체방법으로 활용할 수 있다고 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Poly-pharmacy has been on the rise because of aging of population and chronic disease. Drug–drug interaction evaluation has taken on added importance on the point of drug development period and clinical application. Most of drug metabolism happens in liver, and the metabolism by CYP450 isoenzymes is very much in it. For reasons mentioned above, authorities from all over the world began developing guidelines of the drug–drug interaction research during the development of new pharmaceuticals. Until now, enzymatic activity assay using LC/MS/MS is considered as gold standard for in vitro drug-drug interaction study especally for CYP induction assay. But recently, new assay methods such as mRNA expression measurement and protein assay which have higher sensitivity are considered as an alternative for enzymatic assay in CYP induction assay. In the present work, we compared gene/protein expression assay using qRT-PCR and western blotting with enzymatic assay using LC/MS/MS. For this purpose, we established both enzymatic assay and gene/protein assay using various types of cells such as HepG2, Hep3B, HepaRG and human primary hepatocytes. Among many CYP isoenzymes, CYP3A4, CYP1A2, CYP2C9 and CYP2C19 were selected for experiment based on their responsibilities in drug metabolism. The induction levels of four different CYP isoenzymes were analyzed by enzymatic activity using LC/MS.MS, mRNA expression levels using qRT-PCR and protein expression levels using western blotting. The results demonstrated that measuring mRNA levels is more sensitive method for detecting CYP enzyme induction than LC/MS/MS. But it seemed that the qRT-PCR alone could not replace the enzymatic assay because of its high variability. Measuring protein levels using western blotting did not show any reliable results. Based on the results, we concluded that qRT-PCR method can be used a supplemental method for LC-MS method in case of CYP induction assay and can served as a very efficient alternative screening method for drug-drug interaction at early stage of drug development stage.