초분자 단백질 복합체 및 NMR 분광법을 이용한 리간드 스크리닝 방법 개발 = Methodology development of ligand screening by using supramolecular protein complex and NMR spectroscopy

국문 초록 (Abstract)

신약 개발 시 필수적인 후보 물질의 탐색에 주로 이용되는 리간드 스크리닝 방법은 타겟 단백질과 리간드를 하나씩 섞어 리간드의 신호 변화를 관찰한다. 본 연구를 통해 제안하는 방법은 2차원 NMR을 이용하여 다수의 후보 물질과 타겟 단백질을 한 번에 스크리닝하며, ELP를 이용하여 기존보다 민감하게 신호 변화를 관찰하고 이를 통해 타겟 단백질과 결합하는 리
간드를 찾는다. 이와 같은 새로운 리간드 스크리닝 방법 개발을 목표로 한다.
본 연구를 위해 사용한 ELP는 VPGXG의 5 가지 아미노산이 반복되는 서열을 가지며 온도나 염 농도에 따라 가역적인 불용성 상태로 상전이가 유도된다. 이와 같은 성질을 이용하여 ELP를 타겟 단백질에 융합하여 퓨전 단백질 상태에서도 가역적인 상전이가 일어나도록 하였다. 또한 타겟 단백질와 ELP가 결합하여 초분자 복합체가 만들어지면 작은 신호 변화라도 그
세기를 증폭시켜 기존의 방법보다 신호 변화가 민감하게 관찰되었다. 타겟 단백질과 리간드가 약하게 결합하는 경우에는 실험 온도가 ELP의 전이 온도 이상이 되면 타겟 단백질에 결합된 리간드의 텀블링 속도가 매우 느려지면서 리간드의 신호가 빠른 시간 내에 사라졌다. 타겟 단백질과 리간드가 강하게 결합하는 경우에도 pull-down 형태의 과정이 일어나 그에 상응하는 신호 변화가 스펙트럼에서 관찰되었다.
타겟 단백질이 생물체 내에서 특정 역할을 담당하기 때문에 생체 내 특정 물질과 결합하므로 후보 물질은 대장균의 대사물질을 추출하여 이용하였다. 정상 배지에는 영양요소가 많이 함유되어 있어 대사 물질 추출을 위한 대장균을 배양할 때는 M9 최소 배지를 사용하였다. M9 최소 배지의 탄소원으로 C-13 글루코오스를 사용하여 대사 물질을 C-13으로 치환 후 추출하여 사용하였다.
여러 종류의 ELP를 타겟 유전자 뒤에 합성하여 융합 단백질을 발현하였고 말토오스와 결합한다고 알려진 MBP를 테스트 타겟 단백질로 설정하였다. 최종적으로 MBP-I48을 다양한 리간드와 함께 1차원 NMR을 측정하였고, 타겟 단백질과 리간드의 결합 여부에 따른 스펙트럼의 신호 변화를 확인하였다. 타겟 단백질과 리간드가 결합할 경우, 온도를 전이 온도 이상으로 올리면 단백질의 신호와 리간드의 신호가 같이 줄어들었다. 반면에 타겟 단백질과 리간드가 결합하지 않았을 경우, 단백질의 신호만 줄어들고 리간드의 신호에는 변화가 없는 것을 확인하였다. 1차원 NMR의 결과를 통해 본 연구에서 제시하는 리간드 스크리닝 방법의 정당성을 확인하였고, 이를 2차원 NMR에 응용하여 다수의 후보 물질 풀에서 타겟 단백질과 리간드의 결합을 확인하는 데 적용하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The ligand screening method, which is mainly used for screening candidates,
an essential part of drug development, observes the signal change of ligand by
mixing target protein and ligand one by one. In this study, the proposed method screened a large number of candidates and target proteins at one time
using two-dimensional NMR and observes the signal change of ligand more
sensitively using the ELPs. It was aimed at developing such a new ligand
screening method.
The ELP used for this study had a repeat sequence of the five amino acids
of VPGXG, which induces phase transition into a reversible insoluble state
depending on temperature or salt concentration. Using this property, the ELPs
were fused to a target protein to allow reversible phase transition even in a
fusion protein state. In addition, the target protein and ELP combined to form
a supermolecular complex, so even small signal variations can amplify their
intensity to observe signal changes more sensitively than conventional methods.
In the case where the target protein and the ligand are weakly bound, when
the experimental temperature is higher than the transition temperature of the
ELPs, the tumbling speed of the ligand bound to the target protein was
slowed, and the signal of the ligand was disappeared in a short time. Also
when the target protein and ligand are strongly bonded, a process in the form
of a pull-down was occured and corresponding signal changes were observed
in the spectrum.
Since the target protein plays a specific role in the organism, it would bind
to a specific substance in vivo. So metabolites extracted from E. coli was
used as a candidate material pool. As the normal medium contains a lot of
nutrients, M9 minimal medium was used when culturing E. coli for metabolite
extraction. The metabolites were replaced with C-13 using C-13 glucose as the
carbon source of M9 minimal medium, followed by extraction.
Various kinds of ELPs were synthesized behind the target gene and the
fusion proteins were expressed. MBP, known to bind maltose, was set as the
test target protein. Finally, one-dimensional NMR was measured by binding the
MBP-I48 with various ligands. Depending on whether they bonded or not, it
was able to determine the signal variation in the spectrum. After binding the
protein and ligand, the temperature was set up above the transition
temperature, and as a result, it showed different outcomes. When the target
protein and ligand are bound, if raising the temperature above the transition
temperature reduced the signal of the protein and the ligand. On the other
hand, when they did not bind on each other, only the signal of protein was
reduced and the signal of ligand remained as same. The results of
one-dimensional NMR confirmed the validity of the ligand screening method
presented in this study. By applying this method to two-dimensional NMR, it
enabled the experiment to identify the binding of target proteins and ligands in
a number of candidate material pools.