실뱀 (Orientocoluber spinalis)의 분변 eDNA 내 먹이원 분석용 블로킹 프라이머 개발과 NGS와 클로닝 분석의 효율성 비교

국문 초록 (Abstract)

먹이원에 대한 연구는 한 종의 생태적 지위와 행동권, 행동 특이성을 알 수 있게 해준다. 먹이원 연구 중 분변을 이용한 분자적 분석방법은 연구대상에게 최소한의 스트레스를 주기 때문에 멸종위기종 같이 개체수가 많지 않은 종에게 쓰기 적합하다. 실뱀(Orientocoluber spinalis)은 국내외에 서식 중인 종이며, 특유의 빠른 움직임과 적은 개체수로 인해 연구사례가 많지 않다. 본 연구는 실뱀의 생존에 영향을 미치지 않는 비침습적 먹이원 분석 방법을 개발하기 위해 수행되었다. 이를 위해 범용 척추동물 프라이머를 이용한 PCR 시, 분변 내 실뱀 자신의 DNA 증폭은 막지만, 먹이원 DNA는 증폭시킬 수 있는 블로킹 프라이머를 개발하였다. 이어서, 해당 프라이머를 통해 증폭시킨 실뱀 분변 내 먹이원 DNA를 NGS와 클로닝 방법을 통해 염기서열을 얻고, 이를 바탕으로 분변 eDNA 내 먹이원 분석의 효율을 비교하였다. 연구 결과, 실뱀을 포함한 파충류 8종을 제외한 잠재적인 척추동물 먹이원들의 유전자를 검출할 수 있는 블로킹 프라이머를 개발하였다. 실뱀의 증폭된 분변 eDNA를 NGS로 분석하였을 때 실뱀 3개체에서 각각 1종의 먹이원(도마뱀, 작은땃쥐, 대륙유혈목이)이 검출된 반면, 동일한 시료의 클로닝 분석에서는 1종의 먹이원만 검출되었다. 이러한 결과를 통하여 NGS를 통한 분변 내 먹이원 식별이 클로닝보다 정확도와 비용적인 측면에서 효율적으로 보인다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Research on food sources allows us to know the ecological status, behavioral boundary, and behavioral specificity of a species. Orientocoluber spinalis is a species that lives both domestic and foreign. and there are not many research cases due to their unique fast movement and small number of individuals. This study attempted to study the diets of Orientocoluber spinalis and to develop a non-invasive analysis method that does not affect survival on the research subjects. To this end, a blocking primer was produced to prevent DNA amplification of host Orientocoluber spinalis. In addition, we tried to find out an efficient method by comparing and analyzing the prey sequences obtained through NGS and cloning. As a result of the study, I successfully developed Orientocoluber spinalis blocking primer. And then, in the three feces of a Orientocoluber spinalis, I identified 3 different preys (Tsushima smooth skink, Asian lesser white-toothed shrew, Japanese keelback) using the NGS analysis, but only 1 prey using the cloning analysis. This result suggests that prey identification in feces eDNA of reptiles is more sensitive with the NGS than with cloning analysis and that blocking primer can be used in the reptile diet study using feces eDNA.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 11
• 1. 연구지역 11
• 2. 실험 샘플 획득 12
• 3. 먹이원 분석 15
• Ⅲ. 결과 22
• 1. 실뱀 분변 eDNA 분석을 위한 블로킹 프라이머 개발 22
• 2. 실뱀 분변 eDNA 분석 결과 26
• Ⅳ. 고찰 32
• 1. 실뱀 분변 eDNA 분석을 위한 블로킹 프라이머 개발 32
• 2. 실뱀 분변 eDNA를 이용한 먹이원 분석 33
• 3. 실뱀 분변 eDNA의 NGS와 클로닝 분석 효율성 비교 34
• 4. 결론 35
• Ⅴ. 참고문헌 36
• Ⅵ. 부록 45
• □ 영문초록 71