혈당상승 억제활성을 가진 아르기닌-프럭토즈의 대량생산과 비임상 및 임상 연구 = Large-scale production, preclinical and clinical studies α-glucosidase inhibitor arginyl-fructose

국문 초록 (Abstract)

전 세계적으로 식생활 방식이 육류, 밀가루음식 또는 당분함유 음료 등의 섭취로 당뇨 및 합병증으로 인한 환자수가 증가 추세에 있으며 이에 따른 관련 치료제 및 건강식품소재 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다. 국내에서도 후천적 요인에 의한 제2형 당뇨병이 지속적으로 증가추세에 있으며 현재 혈당조절에 있어서 소장의 glucose 분해 효소인 α-glucosidase의 저해제로 acarbose가 널리 쓰이고 있으나, 복부 팽만감, 복통, 설사 등의 부작용이 보고되고 있다. Acarbose의 부작용을 보완하면서 혈당상승을 억제하는 물질들 중 비효소적 갈변화 반응인 maillard 반응으로부터 생성되는 아마도리 화합물(Amadori Rearrangement Compounds; ARCs)의 일종인 Arginyl-fructose (AF)가 혈당상승 억제 효과가 있는 것으로 보고되었다. AF의 경우 홍삼의 제조 과정 중 생성되는 물질로 IC50이 6.4mM로 동물실험에서 혈당상승 억제 효과가 있다고 보고되었다.

따라서, 본 연구에서는 AF를 이용한 혈당강하 효능을 지니는 건강식품소재에 관한 대량생산과 임상 연구를 목표로 하였다. AF의 합성조건은 arginine와 glucose를 주성분으로 하여 acetic acid로 pH를 변화시켜 가열하는 방식으로 제조하였고 최적의 조건은 대량합성시 arginine과 glucose를 1:1로 혼합하고 10% acetic acid 를 가하여 2시간 동안 가열시 30% 이상 순도의 AF를 획득할 수 있었다. 이와 동시에 정량 및 정성분석을 위한 HPLC 분석법을 다양한 column을 이용하여 확립하였다.

또한, 실험관내 시험을 통해 인간 정상세포주인 제대정맥 내피세포(HUVEC)과 혈관대동맥 평활근세포(HaSMC)에서 10mM 농도까지 처리 했을 때 독성이 없음을 확인하였고, 혈당상승 억제 기전이외의 효능을 확인하기 위한 연구로 cell migration assay와 면역세포 활성 실험을 한 결과 세포의 이동성에는 영향을 미치지 않았지만 면역활성 실험에서 mouse의 비장세포에서 추출한 면역세포들 중 B 림프구 특이적 표면항원인 CD19의 발현을 대조군대비 10배 정도 증가시켜 B 림프구와 관련된 면역활성에 유용하게 쓰일 수 있다고 판단되었다.

당뇨질환 동물모델을 이용한 혈당억제 효과는 고탄수화물 사료의 섭취로 인해 고혈당 및 체중증가를 유발시켜 AF와 acarbose의 효능을 체중의 변화, 혈당분석, 당화혈색소분석, 지질류의 변화, 맹장의 무게 변화 등을 측정하여 비처리군과 비교하였다. 이때 두 가지 물질 모두에서 체중의 증가와 혈당 상증 억제효과를 보였으나 acarbose의 경우 맹장의 무게가 1.6±0.04g으로 AF 처리군 0.27±0.07g 보다 5배 증가하는 것으로 보여 부작용에 의한 것으로 판단되었다. 당화혈색소의 측정에서는 acarbose가 5.1 ± 0.80%로 AF 7.1 ± 0.6에 비해 높았으나 비처리군 9.8 ± 1.0% 보다는 낮은 결과를 보였다. 따라서, 동물모델에서는 AF가 acarbose를 보완할 수 있는 물질로 유효하다고 판단되었다. AF의 상업화를 위해 진행된 독성시험에서는 단회, 2주 반복, 13주 반복 투여 독성을 조사하였고, 복귀돌연변이시험, 염색체이상시험, 골수 소핵다염성 적혈구 이상시험을 수행한 결과 독성이 없는 것으로 나타났다. 13주 반복 독성시험의 최고 농도인 5,000mg/kg/day에서 독성이 없음을 확인하였다. 이상의 연구결과를 통해 AF는 혈당상승 억제 효능을 가지는 새로운 식품소재로써 효과를 확인할 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The present study aimed to determine the large scale production and effects of arginyl-fructose (AF) supplementation on glucose control in the preclinical studies with animal models and clinical studies with prediabetes. AF could be effectively and simply produced only by the addition of 10% acetic acid at 80℃ with mixing in the 1:1 ratio of arginine and glucose. Inhibitory effects of AF on the proliferation and migration of human normal cells(HUVEC and HaSMC) were not revealed at concentration of 10mM. Interestingly, we founded that the CD19+ B cell population in splenocytes (of mice) treated with 10 mM AF was increased in a remarkable level (10 fold), compared to the control. This datum suggested that AF may increase the B cell-specific immune response.
In addition, we have studied the inhibitory effect of AF on blood glucose level in diabetic db/db mice, a genetic model for type 2 diabetes. The db/db mice were randomly assigned to high-carbohydrate diets (66.1% corn starch) with and without AF (4% in the diet) for 6 weeks. Changes in body weight, blood glucose level, and food intake were measured daily for 42 days. Dietary supplementation of AF resulted in a significant decrease of blood glucose level (p < 0.001) and body weight (p < 0.001). The level of HbA1c, a better indicator of plasma glucose concentration over prolonged periods of time, was also significantly decreased for 6-week period (p < 0.001). Dietary treatment of acarbose (0.04% in diet), a positive control, also significantly alleviated the level of blood glucose, HbA1c, and body weight. These results indicate that AF Maillard reaction product improves postprandial hyperglycemia by suppressing glucose absorption as well as decreasing HbA1c level.
Moreover, we performed preclinical and clinical studies to evaluate the toxicity of AF in in vivo. In preclinical studies, AF did not show any severe side effects on 13-week repeated administration. NOAEL (No-Observed-Adverse-Effect-Level) of AF was determined to be 5,000 mg/kg/day in both sexes. In clinical studies with the collaborative research, AF supplementation (1500 mg/day) showed a beneficial effects on control of glucose levels in the blood of human prediabetes group.
Taken above results together, we expect that AF would be a potential anti-hyperglycemic material in the field of heath food research.

목차 (Table of Contents)

• I.서론 1
• II. 재료 및 방법 17
• 1.Arginyl-fructose의 합성 17
• 가. AF 분석 조건 확립 17
• (1) 이온교환 HPLC와 ECD를 이용한 AF 표준품의 분석법 개발 17
• (가) AF 표준품의 이온교환 HPLC 분석조건 설정 17
• (나) 직선성, 검출한계, 정량한계 분석 19
• (다) 시료의 분석 19
• (2) 일반 HPLC와 ELSD를 이용한 AF표준품의 분석법 개발 19
• (가) AF 표준품의 HPLC 분석조건 설정 19
• (나) AF 표준품과 AF 합성물 분석조건 설정 19
• (다) 직선성, 검출한계, 정량한계 분석 21
• (라) 시료의 분석 21
• 나. 합성조건 확립 21
• (1) Arginine, glucose의 배합비에 따른 AF 순도 21
• (2) 빙초산의 농도별 AF의 순도 비교 21
• (3) 반응시간별 합성 수율 비교 22
• 다. 대량합성 조건 확립 22
• (1) Arginine 과 glucose 비율 2:3일 때 합성 방법 22
• (2) Arginine 과 glucose 비율 1:1일 때 합성 방법 22
• 라. Spray-drying 을 통해 제조된 AF 분말제형의 안정성 시험 23
• (1) AF 분말제형의 pH변화에 따른 안정성 확인 23
• (2) AF 분말제형의 온도 변화에 따른 안정성 확인 23
• 2. In vitro assay 24
• 가. 세포주 및 시약 24
• 나. 세포독성 24
• 다. Cell migration assay 24
• 라. 면역세포 활성 측정 25
• 3. In vivo assay 26
• 가. 재료 26
• 나. 동물모델 26
• 다. 혈액분석 28
• 라. 통계분석 28
• 4. 독성시험 29
• 가. 단회독성시험 29
• (1) 동물모델 및 투여농도 29
• (2) 시험방법 29
• 나. 2주 반복독성 시험 31
• (1) 동물모델 및 투여농도 31
• (2) 시험방법 31
• 다. 13주 반복독성 시험 33
• (1) 동물모델 및 투여농도 33
• (2) 시험방법 34
• 라. 복귀돌연변이 시험 36
• (1) 시험균주 및 배지 36
• (2) 대사활성 시스템(S9 mix) 36
• (3) 시험방법 38
• 마. 염색체이상 시험 41
• (1) 세포주 및 배지 41
• (2) AF처리 41
• (3) 관찰 및 검체제작 42
• (4) 결과의 평가 및 해석 42
• 바. 골수 소핵시험 44
• (1) 동물모델 및 투여농도 44
• (2) 관찰 및 시험방법 45
• (3) 골수 채취 46
• (4) 형광현미경 관찰 47
• (5) 골수 채취 47
• (6) 실험의 타당성 조건 47
• 사. 통계 48
• III. 결과 49
• 1. Arginyl-fructose의 합성 49
• 가. 합성조건 확립 49
• (1) 이온교환 HPLC와 ECD를 이용한 AF표준품의 분석법 개발 49
• (2) 일반 HPLC와 ELSD를 이용한 AF표준품의 분석법 개발 49
• (3) Arginine과 fructose 배합비에 따른 조건 실험 56
• (4) 빙초산의 농도별 AF의 합성 수율비교 58
• (5) 반응시간별 합성수율 비교 61
• 나. 대량 합성조건 확립 66
• 다. Spray-drying 을 통해 제조된 AF 분말제형의 안정성 시험 67
• (1) AF 분말제형의 pH 변화에 따른 안정성 확인 67
• (2) AF 분말제형의 온도 변화에 따른 안정성 확인 68
• 2. In vitro assay 69
• 가. 세포독성 69
• 나. Cell migration assay 72
• 다. 면역세포 활성 측정 74
• 3. In vivo assay 78
• 가. 동물모델의 식이 및 체중변화 78
• 나. 혈액분석 80
• 4. 독성시험 81
• 가. 단회독성시험 81
• 나. 2주 반복독성 시험 81
• 다. 13주 반복독성 시험 82
• 라. 복귀돌연변이 시험 82
• 마. 염색체이상 시험 85
• 바. 골수 소핵시험 87
• IV. 고찰 89
• 1. Arginyl-fructose의 합성 89
• 2. In vitro assay 90
• 3. In vivo assay 92
• 4. 독성시험 92
• 5. 임상시험 93
• V. 결론 96
• 참고문헌 97
• 영문요약 104