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      누에 혈림프 유래 Storage-protein 2를 이용한 중간엽줄기세포의 동결보존

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      https://www.riss.kr/link?id=T13417002

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      국문 초록 (Abstract)

      줄기세포 치료는 암, 당뇨, 신경질환과 같은 난치병을 치료할 수 있는 장점이 있으며 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)는 윤리적 문제가 없고, 면역거부반응이 적기 때문에 세포 치료제의 자원으로 매우 유용하게 이용된다.
      줄기세포 치료제의 개발은 크게 줄기세포의 분리, 동결보존, 배양 및 대량배양의 단계로 나눌 수 있다. 이 중에 세포를 장기간 보관하는 동결보존은 매우 중요한 부분이다. 현재 줄기세포의 동결 보호제로서 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용하고 있다. 그러나 FBS는 동물유래 오염원을 유발할 위험이 있으며, 면역거부반응이 일어날 수 있다. 뿐만 아니라, 생산 공정 간 차이로 인해 FBS의 품질이 일정하지 않다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 동결보존시 사용되는 FBS를 대체하고자 누에 혈림프 유래의 storage-protein 2(SP2)를 이용하였다. SP2는 70 kDa의 분자량을 갖는 수용성 단백질로서 누에의 혈림프로부터 얻을 수 있다. SP2는 동물세포의 배양에 있어서 활성 산소의 발생 및 세포 사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다.
      본 연구에서는 hMSCs의 일종인 탯줄유래 중간엽줄기세포(umbilical-cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs)와 지방유래 중간엽줄기세포(adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells, AT-MSCs)를 사용하였다. 90% SP2와 10% DMSO를 혼합한 동결보호제를 이용하였다. 완만동결법(slow-freezing)으로 세포를 동결하였으며 7일간 액체질소에 보관하였다. SP2의 효과를 확인하기 위하여 동결보존시 발생하는 활성산소 및 세포 사멸을 측정하였다. 동결보호제에 첨가할 SP2의 농도를 결정한 후에 세포를 동결하였다. 동결된 세포를 해동(thawing)하여 hMSCs의 특성을 유지하는지 확인하였다. 그 결과, SP2의 사용은 동결보존시 활성산소의 발생과 세포사멸을 억제했다. 동결보호제에 첨가할 SP2의 농도는 5 mg/mL로 결정하여 세포 동결을 수행하였다. 동결 후에도 hMSCs의 특이적 성질과 분화능력을 지속적으로 유지하는 것을 확인하였다.
      결론적으로, SP2는 세포의 변화를 야기하지 않았으며 동결보호제로 사용되는 FBS를 대체할 수 있었다. 본 연구에서는 SP2가 동결보호제로 사용될 수 있는 가능성을 확인하였고, SP2를 이용한 hMSCs의 무혈청 동결보존 방법을 제시하였다.
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      줄기세포 치료는 암, 당뇨, 신경질환과 같은 난치병을 치료할 수 있는 장점이 있으며 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)는 윤리적 문제가 없...

      줄기세포 치료는 암, 당뇨, 신경질환과 같은 난치병을 치료할 수 있는 장점이 있으며 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)는 윤리적 문제가 없고, 면역거부반응이 적기 때문에 세포 치료제의 자원으로 매우 유용하게 이용된다.
      줄기세포 치료제의 개발은 크게 줄기세포의 분리, 동결보존, 배양 및 대량배양의 단계로 나눌 수 있다. 이 중에 세포를 장기간 보관하는 동결보존은 매우 중요한 부분이다. 현재 줄기세포의 동결 보호제로서 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용하고 있다. 그러나 FBS는 동물유래 오염원을 유발할 위험이 있으며, 면역거부반응이 일어날 수 있다. 뿐만 아니라, 생산 공정 간 차이로 인해 FBS의 품질이 일정하지 않다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 동결보존시 사용되는 FBS를 대체하고자 누에 혈림프 유래의 storage-protein 2(SP2)를 이용하였다. SP2는 70 kDa의 분자량을 갖는 수용성 단백질로서 누에의 혈림프로부터 얻을 수 있다. SP2는 동물세포의 배양에 있어서 활성 산소의 발생 및 세포 사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다.
      본 연구에서는 hMSCs의 일종인 탯줄유래 중간엽줄기세포(umbilical-cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs)와 지방유래 중간엽줄기세포(adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells, AT-MSCs)를 사용하였다. 90% SP2와 10% DMSO를 혼합한 동결보호제를 이용하였다. 완만동결법(slow-freezing)으로 세포를 동결하였으며 7일간 액체질소에 보관하였다. SP2의 효과를 확인하기 위하여 동결보존시 발생하는 활성산소 및 세포 사멸을 측정하였다. 동결보호제에 첨가할 SP2의 농도를 결정한 후에 세포를 동결하였다. 동결된 세포를 해동(thawing)하여 hMSCs의 특성을 유지하는지 확인하였다. 그 결과, SP2의 사용은 동결보존시 활성산소의 발생과 세포사멸을 억제했다. 동결보호제에 첨가할 SP2의 농도는 5 mg/mL로 결정하여 세포 동결을 수행하였다. 동결 후에도 hMSCs의 특이적 성질과 분화능력을 지속적으로 유지하는 것을 확인하였다.
      결론적으로, SP2는 세포의 변화를 야기하지 않았으며 동결보호제로 사용되는 FBS를 대체할 수 있었다. 본 연구에서는 SP2가 동결보호제로 사용될 수 있는 가능성을 확인하였고, SP2를 이용한 hMSCs의 무혈청 동결보존 방법을 제시하였다.

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      목차 (Table of Contents)

      • 1. 서 론 1
      • 1.1 세포치료제 1
      • 1.1.1 줄기세포치료제 1
      • 1.1.2 줄기세포치료제 시장 2
      • 1.2 줄기세포 3
      • 1. 서 론 1
      • 1.1 세포치료제 1
      • 1.1.1 줄기세포치료제 1
      • 1.1.2 줄기세포치료제 시장 2
      • 1.2 줄기세포 3
      • 1.2.1 성체줄기세포 11
      • 1.2.1.1 중간엽줄기세포 11
      • 1.2.2 배아줄기세포 12
      • 1.2.3 유도만능줄기세포 13
      • 1.3 줄기세포의 동결보존 13
      • 1.3.1 동결보호제 16
      • 1.3.2 동결보존법 16
      • 1.3.2.1 완만 동결법 16
      • 1.3.2.2 유리화 동결법 17
      • 1.4 누에 유래 단백질 20
      • 1.4.1 Storage-protein 2 20
      • 2. 연구 목적 21
      • 3. 재료 및 방법 22
      • 3.1 성체유래 중간엽줄기세포의 분리 및 배양 22
      • 3.1.1 탯줄유래 중간엽줄기세포의 분리 및 배양 22
      • 3.1.2 지방유래 중간엽줄기세포의 분리 및 배양 22
      • 3.2 Storage-protein 2의 제조 23
      • 3.3 중간엽줄기세포의 동결보존 23
      • 3.4 SDS-PAGE 24
      • 3.5 활성산소종 분석 24
      • 3.6 세포 사멸 측정 25
      • 3.7 세포생존도 측정 25
      • 3.8 WST-1 assay 25
      • 3.9 역전사 중합효소 연쇄반응 26
      • 3.10 세포 면역표지 인자 분석 28
      • 3.11 중간엽줄기세포의 분화 배양 28
      • 3.11.1 뼈세포 분화 28
      • 3.11.2 지방세포 분화 29
      • 3.11.3 연골세포 분화 29
      • 4. 결과 및 고찰 30
      • 4.1 Storage-protein 2의 분리 공정 확립 30
      • 4.2 동결보존 시 SP2의 효능 확인 30
      • 4.2.1 활성산소종 억제 30
      • 4.2.2 세포 사멸 억제 31
      • 4.3 동결보호제에 첨가할 SP2의 농도 결정 35
      • 4.4 동결보존 후 중간엽줄기세포의 특성 확인 35
      • 4.4.1 중간엽줄기세포의 증식 능력 확인 35
      • 4.4.2 중간엽줄기세포의 특이적 유전자 발현 비교 36
      • 4.4.3 세포표지자 발현 확인 36
      • 4.5 뼈, 연골, 지방 세포로의 분화 확인 41
      • 5. 결 론 43
      • 6. 참고문헌 44
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