양볼락과 (Family Scorpaenidae) 어종에 기생하는 Microcotyle 속 단생흡충 (Genus Microcotyle: Monogenea)에 대한 연구 = The study of gill monogenea (Genus Microcotyle) in scorpaenid fish

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Monogeneans (Platyhelminthes) are common ectoparasitic flatworms of fish, infecting the body surfaces such as the skin, fins and gills. Monogeneans have a short direct life-cycle with no intermediate hosts, which facilitates their rapid propagation in aquaculture environments. The infected host fish show anemia and dyspnea with considerable mortality, but may remain in a state of chronic infections.
In Korea, Microcotyle sebastis is a well-known gill parasite of cultured Korean rockfish (Sebastes schlegeli), causing economic loss. Sebastid fish, including Korean rockfish are considered economically valuable species in Korea for commercial fisheries. In addition to Korean rockfish, artificial propagation of several sebastid species juveniles is also established, and they are considered potential candidates for aquaculture. But, there is no information on the gill monogenean fauna of these sebastid species, and they can be a potential threat to the sebastid fish aquaculture industry. In this study, of 682 sebastid fish (S. schlegeli, Sebastes inermis, Sebastes thompsoni, Sebastes taczanowskii, Sebastes steindachneri, Sebastes owstoni, Sebastes pachycephalus, Sebastiscus marmoratus and Sebastiscus tertius) examined, 243 fish were infected with monogeneans in their gills. The number of monogeneans collected were 1,501 in total. 5 species of monogeneans including M. sebastis were found in 7 sebastid fish species; Microcotyle caudata (of S. inermis) and Microcotyle kasago (of S. marmoratus) are previously reported from Japan. Two different Microcotyle species were also found from two Sebastid fish (S. thompsoni, S. taczanowskii), which have not been described elsewhere up to date. They were identified based on the morphology of the genital atrium and mtDNA cox1 gene sequences and these criteria are considered as useful tools for unambiguous species identification of microcotylid monogenean.
Mitogenome sequencing was performed with 3 Microcotyle species (M. caudata, M. kasago, and Microcotyle sp. of S. taczanowskii). As a result, the specific gene order and codon usage of the genus Microcotyle were found in the 3 mitogenomes. In addition, the phylogenetic analysis using mitogenome clearly showed the taxonomic level of the genus Microcotyle in the class monogenea. Thus, mitogenome is a useful genetic marker for molecular identification of genus Microcotyle.
PCR-RFLP targeting mitochondrial cox1 gene, was designed for discriminating M. sebastis and M. caudata. The AseI enzyme treatment with the PCR products showed that M. sebastis were cleavaged while M. caudata did not. 98.6% (1,004/1,018) of monogeneans from S. schlegeli were identified as M. sebastis, and 98.4% (316/321) of monogeneans from S. inermis were identified as M. caudata by PCR-RFLP. Whereas, 5 monogeneans from S. schlegeli were identified as M. caudata (5/1,018), and 5 monogeneans from S. inermis were identified as M. sebastis (5/321). These 10 monogeneans were identified as M. caudata and M. sebastis also by ITS region-based PCR-RFLP. The PCR-RFLP method in this study will help investigate the differential diagnosis and epidemiology of Microcotyle species in two sebastid fish.
The temperature strongly influenced on fertility and viability of M. caudata and M. sebastis. The average amount of oviposition of M. caudata after 48 hours incubation were 36.5±0.9 per individual at 10℃, 45.3±8.2 at 15℃, 30.3±2.9 at 20℃, 16.4±1.6 at 25℃. And those of M. sebastis were 31.8±1.5 at 10℃, 46.5±8.3 at 15℃, 57.9±6.4 at 20℃, and 26.5±2.2 at 25℃. M. caudata showed the highest fertility at 15℃, whereas M. sebastis showed the highest fertility at 20℃. In addition, the average survival period of M. caudata showed 7.4±0.4 days at 10℃, 4.4±0.1 days at 15℃, 3.5±0.4 days at 20℃, and 1.8±0.1 days at 25℃. M. sebastis showed 11.4±2.2 days at 10℃, 7.0±0.3 days at 15℃, 4.3±0.8 days at 20℃, and 3.4±0.3 days at 25℃. The average time required to hatch eggs decreased as the temperature increased. The highest egg hatching rate was observed at 15℃ for M. caudata and 20℃ for M. sebastis. Meanwhile, M. sebastis and M. caudata appeared to different distribution patterns within the gills cavity of each host species. There are intensively distributed on the second gill arch, M. caudata was mainly distributed in the dorsal segment and M. sebastis was mainly distributed in the medial segment.
The efficacy of various anti-helminthic agents and disinfectants were evaluated in vitro against adults and eggs of the M. sebastis and M. caudata, respectively. Praziquantel (PZQ), ivermectin (IVM), trichlorfon (TCF), fenbendazole (FNBZ), febantel (FBT), flubendazol (FLBZ) and thiabendazole (TBZ), formalin, H2O2, NaClO were selected as test chemicals. The hatching rate of M. sebastis and M. caudata eggs was significantly reduced when compared with the control group (seawater; M. sebastis = 86.7%±0.5, M. caudata = 83.0%±0.5) by at least 33.3% in formalin (200, 300 mg/L), H2O2 (50-200 mg/L), and NaClO (75-200 mg/L) treatment. However, 7 anti-helminthic agents, including PZQ, did not effectively inhibit hatching of eggs. In addition, 50-200 mg/L NaClO treatment significantly killed M. sebastis and M. caudata adults when compared with the control group. IVM 200 mg/L for 30 min treatment showed 100% killing activity of M. sebastis adults and 80% of M. caudata adults. However, PZQ, TCF, FNBZ, FBT, FLBZ and TBZ treatment showed less than 33% mortalities. PZQ 200 mg/L for 30 min treatment showed 99.2% detachment of M. sebastis attached to the gills, and 100% detachment of M. caudata at the same PZQ conditions. IVM 200 mg/L detachment or killed more than 83% of M. sebastis and M. caudata attached to the gills. However, all the other chemicals showed weak effect. This result shows that PZQ and IVM immersion treatments are effective to control M. sebastis and M. caudata in sebastid species aquaculture, and formalin, H2O2 and NaClO are effective against eggs.
In this study, the microcotylid monogenean diversity of sebastid fish in Korea and their taxonomic status were investigated. In addition, information on physiological characteristics and control strategies of M. caudata and M. sebastis were provided. In Korea, S. schlegeli is cultured in a large scale and other sebastid fish (S. inermis, S. thompsoni and S. marmoratus) are also propagated in a small scale. These fish species are promising candidate aquaculture species but their production can be affected by harmful microcotylid monogenean infection. The results presented in this study provide comprehensive information on potential microcotylid monogenean infection in Korea.

국문 초록 (Abstract)

단생흡충은 숙주의 체표, 아가미 등에 감염하는 체외기생성 편형동물이다. 단생흡충은 생활사 내에 하나의 숙주만이 필요한 단순한 생활사를 가지고 있는데, 이러한 생활사는 재감염에 필요한 단계가 간단하여 숙주 어류를 고밀도로 사육하는 양식 환경에서는 감염강도가 급속도로 증가될 수 있다. 감염된 숙주 어류는 빈혈과 호흡곤란 등의 증상이 발생할 수 있으나, 만성감염으로 남을 수도 있다.
우리나라에서는 양식산 조피볼락 (Sebastes schlegeli)에 Microcotyle sebastis가 감염하여 심각한 피해를 유발하고 있다. 그런데 국내 연안에는 조피볼락 외에도 다양한 양볼락과 어종이 서식하고 있으며, 일부 종은 시험적으로 양식되고 있다. 그러나 아직 조피볼락 이외에 다른 어종에 대해서는 단생흡충에 대한 조사가 수행되지 않았다. 따라서 M. sebastis외에도 다른 단생흡충이 차후 볼락류 양식시설에서 발병하여 문제가 될 수 있다. 본 연구에서는 총 682개체의 양볼락과 어종 (S. schlegeli, Sebastes inermis, Sebastes thompsoni, Sebastes taczanowskii, Sebastes steindachneri, Sebastes owstoni, Sebastes pachycephalus, Sebastiscus marmoratus, Sebastiscus tertius)을 채집한 결과 243마리가 Microcotyle 속 단생흡충에 감염되어 있었으며, 1,501개체의 Microcotyle 속 단생흡충이 분리되었다. M. sebastis를 포함한 5종의 Microcotyle 속 단생흡충이 7종의 양볼락과 어종에서 발견되었다. 볼락 (S. inermis)에서 발견된 Microcotyle caudata와 쏨뱅이 (S. marmoratus)에서 발견된 Microcotyle kasago는 지리적으로 인접한 일본에서 보고된 종이었다. 불볼락 (S. thompsoni)과 탁자볼락 (S. taczanowskii)에서 발견된 2종은 미기록 종으로 확인되었으며 차후 신종으로 보고할 계획이다. 또한 생식강의 형태와 mtDNA cox1 유전자를 함께 사용한 동정법은 Microcotyle 속 단생흡충을 종수준까지 명확하게 동정할 수 있는 방법으로 확인되었다.
3종의 Microcotyle 속 단생흡충 (M. caudata, M. kasago, Microcotyle sp. of S. taczanowskii)을 대상으로 mitogenome sequencing을 수행하였다. 그 결과 3종의 mitogenome에서는 Microcotyle 속의 특이적인 유전자 배열과 코돈 사용이 확인되었다. 또한 mitogenome을 사용한 계통분석은 단생강 내에서 Microcotyle 속의 분류학적 수준을 명확히 나타내었다. 따라서 mitogenome은 Microcotyle 속 단생흡충의 분자생물학적 동정에 유용한 유전자 marker로 확인되었다.
M. sebastis와 M. caudata를 구별하기 위해 mtDNA cox1 영역을 기반으로 PCR-RFLP를 설계하였다. AseI 효소를 처리한 결과 M. sebastis의 cox1 유전자는 분절된 반면, M. caudata는 분절되지 않았다. 조피볼락에서 분리된 Microcotyle 속 단생흡충의 98.6% (1,004/1,018)는 M. sebastis로 동정되었으며, 볼락에서 분리된 Microcotyle 속 단생흡충의 98.4% (316/321)는 M. caudata로 동정되었다. 반면, 조피볼락에서 분리된 5개체는 M. caudata (5/1,018)로 동정되었으며 볼락에서 분리된 5개체는 M. sebastis (5/321)로 동정되었다. 해당 10개체는 ITS 영역을 기반으로 설계된 PCR-RFLP에서도 혼합감염으로 확인되었다. 본 연구에서 개발한 PCR-RFLP법은 조피볼락과 볼락에 기생하는 Microcotyle 속 단생흡충의 감별진단과 역학 조사에 사용될 것으로 기대된다.
수온은 M. caudata와 M. sebastis의 생식능력과 생존기간에 강한 영향을 미쳤다. 배양 48시간 후 M. caudata의 평균 산란량은 10℃에서 36.5±0.9개, 15℃에서 45.3±8.2개, 20℃에서 30.3±2.9개, 25℃에서 16.4±1.6개였다. 그리고 M. sebastis는 10℃에서 31.8±1.5개, 15℃에서 46.5±8.3개, 20℃에서 57.9±6.4개, 25℃에서 26.5±2.2개였다. M. caudata의 생식능력은 15℃에서 가장 높았으며, M. sebastis는 20℃에서 가장 높았다. 또한, M. caudata의 평균 생존 기간은 10℃에서 7.4±0.4일, 15℃에서 4.4±0.1일, 20℃에서 3.5±0.4일, 25℃에서 1.8±0.1일이었으며, M. sebastis의 평균 생존 기간은 10℃에서 11.4±2.2일, 15℃에서 7.0±0.3일, 20℃에서 4.3±0.8일, 25℃에서 3.4±0.3일로 확인되었다. 수정란의 발달 기간은 수온이 높아질수록 감소하였으며, M. caudata 수정란의 부화율은 15℃에서 가장 높으며, M. sebastis의 수정란은 20℃에서 가장 높았다. 한편, M. caudata와 M. sebastis는 아가미 내에서 서로 다른 분포 패턴을 나타내었다. 두 종 모두 2번째 새엽에 가장 많이 분포하지만, M. caudata는 dorsal segment에 주로 분포하고, M. sebastis는 medial segment에 주로 분포하였다.
M. sebastis 및 M. caudata의 수정란과 성충에 대한 다양한 화합물의 구제 효과를 in vitro 조건에서 비교하였다. Formalin, hydrogen peroxide, chlorine, Praziquantel (PZQ), ivermectin (IVM), trichlorfon (TCF), fenbendazole (FNBZ), febantel (FBT), flubendazol (FBZ), thiabendazole (TBZ) 등 10가지의 화합물을 선택하여 실험에 사용하였다. M. sebastis와 M. caudata의 수정란은 formalin (200, 300 mg/L), hydrogen peroxide (50-200 mg/L), NaClO (75-200 mg/L)를 처리시 멸균해수 (M. sebastis = 86.7%±0.5, M. caudata = 83.0%±0.5)에 비해 부화율이 33.3% 이하로 유의하게 감소하였다. 그러나 PZQ를 포함한 7가지 (PZQ, IVM, TCF, FBZ, FBT, FLBZ, TBZ)의 항기생충제는 수정란의 부화에 영향을 미치지 않았다. 50-200 mg/L NaClO는 M. sebastis 및 M. caudata의 성충을 효과적으로 사멸시켰다. 또한, 200 mg/L의 IVM은 M. sebastis 성충을 100% 사멸시키고, M. caudata 성충을 80% 사멸시켰다. 그러나 200 mg/L의 PZQ, TCF, FNBZ, FBT, FLBZ, TBZ는 33% 이하의 개체를 사멸시켰다. 아가미에 부착된 M. sebastis 성충은 200 mg/L의 PZQ 처리시 99.2% 탈락되었으며, M. caudata 성충은 100% 탈락하였다. 이때 탈락된 개체는 모두 생존하였다. 200 mg/L의 IVM은 아가미에 부착된 M. sebastis 및 M. caudata 성충을 83% 이상 탈락시키거나 사멸시켰다. 본 연구 결과 200mg/L의 PZQ, IVM은 숙주의 아가미에 부착되어 있는 M. sebastis 및 M. caudata 성충을 효과적으로 탈락시키거나 사멸시켰다. 그러나 두 화합물은 수정란의 부화를 억제하지 못하였다. 반면, formilin, H2O2, NaClO는 수정란의 부화를 효과적으로 억제하였다. 따라서 Microcotyle 속 단생흡충을 효과적으로 제거하기 위해서는 두 가지 방식의 복합적인 처리법이 필요하다.
본 연구에서는 국내 연안에 분포하는 Microcotyle 속 단생흡충의 종 다양성을 보고하고 해당 종들의 분류학적 수준을 명확히 하였다. 또한, M. sebastis 및 M. caudata의 감염증에 대응할 수 있는 여러 생리학적 특성이나 구제방안에 대한 정보를 제공하였다. 국내에서는 조피볼락이 대량으로 양식되고 있으며, 볼락, 불볼락, 쏨뱅이 등이 소규모로 양성되거나 방류용 종묘로 생산되고 있다. 양볼락과 어종은 국내에서 자원 가치가 높은 만큼 차후에도 다양한 종이 양식될 것으로 전망되나, 양식 환경에서는 어종에 따라 다양한 종의 Microcotyle 속 단생흡충이 감염하여 피해를 유발할 수 있다. 본 연구 결과는 차후 국내에서 발생할 수 있는 Microcotyle 속 단생흡충에 대한 종합적인 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• List of Tables ⅰ
• List of Figures ⅲ
• Abstract ⅸ
• 제 1장. 서론
• 1. 단생흡충 (Monogenea)의 일반적인 특성 1
• 2. 형태학적 특징과 숙주 특이성 4
• 3. 생활사 및 번식전략 8
• 4. 단생흡충 감염증의 관리 대책 10
• 5. 국내 양볼락과 (Scorpaenidae) 어종의 양식 현황 및 단생류 감염증 11
• 6. 연구목적 13
• 제 2장. 양볼락과 (Family Scorpaenidae) 어종에 기생하는 단생흡충 (Monogenea; Platyhelminthes)
• 1. 서론 14
• 2. 재료 및 방법
• 1) 어류 시료 채집 16
• 2) 표본시료 제작 및 측정 19
• 3) Genomic DNA 추출 20
• 4) PCR amplification 20
• 5) 분자계통 분석 21
• 3. 연구 결과
• 1) 양볼락과 어종에 기생하는 Microcotyle 속 단생흡충의 종 분포 23
• 2) Microcotyle 속 단생흡충의 형태학적 특징 25
• 3) 분자계통분석 결과 38
• 4. 고찰 45
• 제 3장. Microcotyle (Microcotylidae; Monogenea) 속 단생흡충의 mitogenome 분석
• 1. 서론 48
• 2. 재료 및 방법
• 1) 기생충 시료 수집 및 동정 50
• 2) Mitogenome sequencing 및 annotation 51
• 3) 계통분석 (phylogenetic analysis) 및 유전자 배열 (gene order) 조사 52
• 3. 연구 결과
• 1) Mitogenome의 구조 및 크기 54
• 2) Protein-coding genes (PCGs) 및 codon usage 58
• 3) tRNA, rRNA gene 및 Non-coding region 58
• 4) 계통분석 및 유전자 배열 65
• 4. 고찰 67
• 제 4장. Microcotyle sebastis 및 Microcotyle caudata를 감별진단하기 위한 PCR-RFLP법의 개발
• 1. 서론 69
• 2. 재료 및 방법
• 1) 시료 수집 및 형태학적 동정 72
• 2) Genomic DNA 추출 75
• 3) PCR amplification 75
• 4) PCR-RFLP의 설계 76
• 5) PCR-RFLP법을 사용한 현장시료 조사 76
• 3. 연구 결과
• 1) Microcotyle 속 단생흡충의 감염율 (prevalence) 및 감염강도 (abundance) 조사 78
• 2) Microcotyle 속 단생흡충의 분자생물학적 동정 78
• 3) Restriction fragment length polymorphisms (RFLP) 81
• 4) RFLP법의 유효성 평가 및 양식산 조피볼락 및 볼락의 단생흡충 종 분포 조사 81
• 4. 고찰 85
• 제 5장. Microcotyle 속 단생흡충의 생리학적 특성: 아가미 내 분포 패턴 및 수온에 따른 기생충의 생식능력 조사
• 1. 서론 88
• 2. 재료 및 방법
• 1) 숙주 어류 채집 90
• 2) 볼락 및 조피볼락에 기생하는 단생흡충의 microhabitat 조사 90
• 3) 수온에 따른 수정란 생산량 및 생존 기간 조사 92
• 4) 수온에 따른 수정란의 부화율 조사 92
• 5) PCR-RFLP를 사용한 감별진단 93
• 6) 통계처리 93
• 3. 연구 결과
• 1) 볼락 및 조피볼락에 기생하는 단생흡충의 microhabitat 조사 94
• 2) 수온에 따른 수정란 생산량의 변화 97
• 3) 수온에 따른 생존 기간의 변화 101
• 4) 수온에 따른 수정란의 발달 기간 및 부화율의 변화 104
• 5) PCR-RFLP 결과 104
• 4. 고찰 107
• 제 6장. In vitro에서 다양한 소독제 및 구충제를 통한 M. sebastis와 M. caudata의 구제 효과 확인
• 1. 서론 111
• 2. 재료 및 방법
• 1) 시료 채집 113
• 2) 실험 준비 및 화합물의 농도 114
• 3) 수정란 (fertilized egg)에 대한 다양한 화합물의 in vitro 처리 효과 비교 116
• 4) 성충 (adult worm)에 대한 다양한 화합물의 in vitro 처리 효과 비교 116
• 5) PCR-RFLP를 사용한 감별진단 117
• 6) 통계처리 117
• 3. 연구 결과
• 1) 수정란 (fertilized egg)에 대한 다양한 화합물의 in vitro 처리 효과 118
• 2) 성충 (adult worm)에 대한 다양한 화합물의 in vitro 처리 효과 비교 121
• 3) 아가미에 부착된 Microcotyle 속 성충에 대한 다양한 화합물의 in vitro 처리 효과 비교 124
• 4) PCR-RFLP 결과 124
• 4. 고찰 127
• 제 7장. 종합고찰 131
• 제 8장. 국문요약 137
• 제 9장. 참고논문 139