십자화과 채소류 추출물이 Proteasome 활성에 미치는 영향 = Effects of Cruciferous Vegetables Extracts on Proteasome Activities

국문 초록 (Abstract)

26S proteasome은 진핵세포의 주요 protease로, 다양한 세포 경로를 조절하고 잘못 접히거나 응집되기 쉬운 손상된 단백질을 제거하여 세포 내의 단백질을 유지한다. NF-κB는 세포사멸을 억제하고 혈관신생, 세포 증식 및 이동을 유도하여 종양 형성에 결정적인 역할을 하는데, 26S proteasome은 세포질에서 비활성화 상태로 존재하는 NF-κB가 핵 안으로 이동하여 활성화 상태가 되도록 유도한다. 따라서 26S proteasome의 억제는 NF-κB의 기능을 조절하여 암 발생을 예방하는데 있어 중추적인 역할을 할 수 있다. 본 연구에서는 전 세계적으로 많이 소비되고 식물생리활성물질이 풍부한 십자화과 채소 중 양배추, 적양배추, 콜라비, 브로콜리, 케일을 선정하여 항암 및 항산화 효과를 확인하기 위해 간암 세포에서 채소류 추출물의 세포 증식, 항산화능 및 항산화 성분 함량, proteasome 억제 효과, NF-κB 활성 억제 효과를 평가하였으며, proteasome 억제 효과가 높았던 케일과 적양배추를 LC-MS를 통해 분석하였다. MTT assay를 이용한 세포 증식 실험에서 5가지의 채소류 추출물 모두 유의적으로 세포 증식률을 감소시켰다(p<0.05). DPPH, ABTS, CAA assay를 이용한 항산화능 측정 실험에서는 적양배추와 케일 추출물이 유의적으로 높은 항산화능을 보였다(p<0.05). 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정을 이용한 항산화 성분 함량 측정 실험에서는 항산화능 측정 실험 결과와 동일하게 적양배추와 케일 추출물이 유의적으로 높은 항산화 성분 함량을 나타냈다(p<0.05). Proteasome 역가 저해율 측정 실험 결과, 세포 추출물을 이용한 CE assay에서는 5가지의 채소류 추출물이 모두 유의적으로 proteasome 억제 효과를 보이지 않았지만, 세포 내 proteasome 역가 저해율을 측정하는 CPIA assay에서는 5가지의 채소류 추출물 모두 유의적으로 proteasome 억제 효과를 보였으며, 특히 케일 추출물이 농도 의존적으로 유의하게 가장 높은 proteasome 역가 저해율을 나타냈다(p<0.05). 또한, proteasome 억제 효과가 있다고 알려진 genistein과 배당체인 genistin, 6“-O-Malonylgenistin, 6”-O-Acetylgenistin의 proteasome 역가 저해율 측정에서는 CE assay에서 효과가 없었던 6”-O-Acetyl genistin이 CPIA assay에서 유의적으로 가장 높은 proteasome 역가 저해율을 보였다(p<0.05). 케일 추출물이 NF-κB 활성에 미치는 영향을 western blot 실험을 통해 확인한 결과, 100μg/mL 농도에서 NF-κB 활성이 유의적으로 억제되었다(p<0.05). Proteasome 역가 저해율이 가장 높았던 케일 추출물을 용매별로 분획하여 proteasome 역가 저해율 측정 실험을 진행한 결과, hexane, chloroform, ethyl acetate 분획물에서 유의적으로 proteasome 억제 효과를 나타내었다(p<0.05). 케일 추출물과 분획물들을 LC-MS로 분석한 결과에서는 검출기 파장 320nm의 경우 ethyl acetate 분획물, 검출기 파장 450nm의 경우 hexane 및 ethyl acetate 분획물에서 다른 분획물들에 비해 면적 값이 큰 peak가 분석되었다. 특히, hexane 분획물에서는 carotenoid 계열의 lutein이 분석되었고, ethyl acetate 분획물에서는 hydroxycinnamic acid 계열의 trisinapoyl-diglucoside를 포함하여 다양한 polyphenols가 분석되었다. 적양배추 추출물은 LC-MS 분석을 통해 16가지의 cyanidin 배당체를 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 양배추, 적양배추, 콜라비, 브로콜리, 케일은 천연 항산화제 및 proteasome 억제제로 활용될 수 있으며, 특히 케일은 다양한 식물생리활성물질들이 proteasome 억제제로 작용할 수 있고, 적양배추는 cyanidin 계열의 물질들이 proteasome 억제제로 작용할 수 있다는 점을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The 26S proteasome is a major protease in eukaryotic cells. It maintains intracellular proteins by regulating various cellular pathways and removing damaged proteins that are prone to misfolding or aggregation. NF-κB plays a crucial role in tumorigenesis by inhibiting apoptosis and inducing angiogenesis, cell proliferation, and migration. The 26S proteasome induces NF-κB, which is in an inactive state in the cytoplasm, to move into the nucleus and become an activated state. Therefore, inhibition of the 26S proteasome can play a pivotal role in preventing cancer by regulating the function of NF-κB. In this study, cabbage, red cabbage, kohlrabi, broccoli, and kale were selected among cruciferous vegetables consumed worldwide and rich in phytochemicals. In order to confirm anticancer and antioxidant effects, cell proliferation, antioxidant capacity and antioxidant component content, proteasome inhibitory effect, and NF-κB activation inhibitory effect of vegetable extracts were evaluated in liver cancer cells. In addition, kale and red cabbage, which had high proteasome inhibitory effects, were analyzed by LC-MS. In the cell proliferation experiment using the MTT assay, all five vegetable extracts significantly reduced the cell proliferation rates (p<0.05). In the antioxidant activity measurement experiments using DPPH, ABTS, and CAA assays, red cabbage and kale extracts showed significantly high antioxidant activities (p<0.05). In the antioxidant component content measurement experiments using the total polyphenol and total flavonoid content measurement, the red cabbage and kale extracts showed significantly high antioxidant component contents (p<0.05), same as the results of the antioxidant activity measurement experiments. As a result of the proteasome titer inhibition rate measurement experiment, all five vegetable extracts did not show significant proteasome inhibitory effects in the CE assay using cell extracts, but in the CPIA assay that measures the intracellular proteasome titer inhibition rate, all five vegetable extracts showed significant proteasome inhibitory effects. In particular, kale extract showed the highest proteasome titer inhibition rate in a dose-dependent manner (p<0.05). In addition, in the measurement of the proteasome titer inhibition rate of genistein, which is known to have proteasome inhibitory effect, and the glycosides genistin, 6“-O-Malonylgenistin, and 6”-O-Acetylgenistin, 6”-O-Acetylgenistin, which had no effect in the CE assay, showed the highest proteasome titer inhibition rate in the CPIA assay (p<0.05). As a result of confirming the effect of kale extract on NF-κB activity through western blot experiment, NF-κB activity was significantly inhibited at a concentration of 100μg/mL (p<0.05). The kale extract, which had the highest proteasome titer inhibition rate, was fractionated for each solvent, and the proteasome titer inhibition rate measurement experiment was conducted. As a result, the hexane, chloroform, and ethyl acetate fractions showed significant proteasome inhibitory effects (p<0.05). As a result of analyzing kale extracts and fractions by LC-MS, peaks with larger area values than other fractions were analyzed in the ethyl acetate fraction at a detector wavelength of 320nm and in the hexane and ethyl acetate fractions at a detector wavelength of 450nm. In particular, lutein of the carotenoid series was analyzed in the hexane fraction, and various polyphenols including trisinapoyl-diglucoside of the hydroxycinnamic acid series were analyzed in the ethyl acetate fraction. In the red cabbage extract, 16 types of cyanidin glycosides were identified through LC-MS analysis. Therefore, in this study, it was confirmed that cabbage, red cabbage, kohlrabi, broccoli, and kale can be used as natural antioxidants and proteasome inhibitors. In particular, it was confirmed that various phytochemicals contained in kale can act as proteasome inhibitors, and various cyanidin substances contained in red cabbage can act as proteasome inhibitors.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 11
• 1. 실험 재료 11
• 1) 시료 및 세포 11
• 2) 시약 및 기기 11
• 2. 실험 방법 14
• 1) 십자화과 채소류 추출물 제조 14
• 2) 케일 추출물 및 분획물 제조 14
• 3) HepG2 세포 배양 15
• 4) 세포 독성 측정 (Cell cytotoxicity) 17
• 5) 세포 증식 측정 (Cell proliferation) 18
• 6) 항산화능 측정 19
• ① DPPH assay 19
• ② ABTS assay 19
• ③ Cellular Antioxidant Activity (CAA) assay 20
• 7) 항산화 성분 함량 측정 21
• ① 총 폴리페놀 함량 측정 21
• ② 총 플라보노이드 함량 측정 21
• 8) Proteasome 역가 저해율 측정 22
• ① Cell Extract Proteasome Inhibitory Activity (CE) assay 22
• ② Cellular Proteasome Inhibitory Activity (CPIA) assay 23
• 9) Western blot 24
• 10) LC-MS를 이용한 proteasome 억제 물질 분석 26
• 11) 통계처리 31
• Ⅲ. 결과 및 고찰 32
• 1. 십자화과 채소의 세포 독성 (Cell cytotoxicity) 32
• 2. 십자화과 채소의 세포 증식 (Cell proliferation) 32
• 3. 십자화과 채소의 항산화능 37
• 1) DPPH 라디칼 소거능 37
• 2) ABTS 라디칼 소거능 37
• 3) 세포 내 항산화능 (CAA) 37
• 4. 십자화과 채소의 항산화 성분 함량 41
• 1) 총 폴리페놀 함량 41
• 2) 총 플라보노이드 함량 41
• 5. 십자화과 채소의 proteasome 역가 저해율 44
• 1) 십자화과 채소의 proteasome 역가 저해율 스크리닝 44
• 2) 케일의 농도별 proteasome 역가 저해율 47
• 6. Genistein 및 배당체의 proteasome 역가 저해율 49
• 7. 케일에 의한 NF-κB 활성 변화 51
• 8. Proteasome 억제 물질 분석 53
• 1) 케일 추출물 및 분획물의 proteasome 역가 저해율 비교 53
• 2) 케일 추출물 및 분획물의 LC-MS 분석 55
• 3) 적양배추 추출물의 LC-MS 분석 61
• Ⅳ. 결론 63