Gene Expression and Characterization of the Recombinant Korean Mistletoe (Viscum Album Coloratum) Lectin : 한국산 겨우살이 렉틴 유전자의 발현 및 특성에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

한국산 겨우살이 렉틴은 이황화 결합(di-sulfide bond)으로 결합된 A와 B사슬(chain)로 이루어져 있다. 선행 연구를 통해 한국산 겨우살이 렉틴이 cytokine 분비 증가, NK세포 활성화와 같은 면역반응의 증장으로 인해 항암 효과를 증가시킨다는 것이 밝혀졌다. 게다가 한국산 겨우살이 렉틴은 인플루엔자 바이러스 항원과 함께 경비 (intra-nasal)로 쥐에 투여했을 때 강한 점막 면역 증강 효과를 보였다. 이에 관련한 기작을 연구하기 위해 우리는 한국산 겨우살이 렉틴 유전자의 cDNA를 클론했다. 그리고 렉틴의 A와 B 각각의 유전자를 대장균 시스템을 이용해서 수용성 단백질 형태로 독립적으로 발현하고 Ni-NTA 컬럼을 통해 정제하고 그 생물학적인 활성을 분석하였다. 재조합 한국산 겨우살이 렉틴 A1 단백질은 겨우살이에세 추출된 렉틴 (KML-C), 유럽산 겨우살이 렉틴과 유사한 리보좀-불활성화 효과 (Ribosome Inactivating Activity)를 보였다. 하지만 암세포 살상 효과에서는 이 두 대조군에 비해 훨씬 감소된 효과를 보였는데, 이는 세포 표면에 부착해서 내부로 들어갈 수 있도록 도와주는 역할을 하는 것으로 알려진 B chain의 결여 때문일 것으로 생각된다. 또한 재조합 A1 단백질은 쥐 대식세포주인 Raw264.7을 자극해서 TNF-α와 같은 cytokine을 분비를 자극했다. 재조합 B1 단백질의 발현과 정제도 역시 완료되었는데, B1 단백질은 재조합 단백질로 발현하는데 매우 독특한 특성을 가진 것으로 보인다. 그래서 그 생산성이 재조합 A1 단백질에 비해 현저히 떨어졌고, 순수한 B1 단백질 분리를 위해서 더 강한 정제 조건이 적용되어야 했다. B1 단백질의 특성에 관한 연구는 진행 증이다. 이 연구는 한국산 겨우살이 렉틴이 점막 면역 증강제로 개발되는 데, 또한 그 면역 증강 기작을 규명하는 데 필용한 지식과 기반을 제공할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Korean mistletoe pectin (KML) is composed of an A chain and a B chain bridged with a di-sulfide bond. Previous studies demonstrated that the KML increased an anti-cancer activity via augmented immune responses, such as cytosine induction and NKr cell activation. In addition, the KML showed a strong m.cosap adjutant effect in mice when treated along with influenza virus antigens. To study the underlying mechanism, we cloned the DNA of the Korean mistletoe pectin (KML) gene. The KML genes of A and B were independently expressed as soluble recombinant proteins using an Esclrericlzia cola system, purified via a Ni-NTA column and then characterized their b opogicap activities. The recombinant KML-A1 chain (rKML-A1) showed a strong ribosome inactivating activity in an an voter analysis, which is similar to that of the wild type KML and European mistletoe pectin. The rKML-A1, however, showed a significantly reduced cancer cell kipping activity. This may be due to pack of help of the B chain for the target cell entry of the A chain. The rKML-A1 also induced cytosine production, such as TNF-α, from a macrophage cell pine (RAW264.7). Expression and purification of the rKML-B1 chain was also completed. The property of rKML-B1 may be unusual to express and purify as a recombinant protein. In contrast to rKML-A1, therefore, protein yield of soluble rKML-B1 was very low and also rKML-B1 was purified in the harsh conditions to get pure eluted protein. Characterization of the bioactivities of the rKML-B1 is currently underway. This study will give us fundamental materials and knowledge for further study of mucosap adjutant development and adjutant mechanism.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS = ⅴ
• Abstract = ⅰ
• 국문 초록 = ⅲ
• List of Figures = ⅶ
• List of Tables = ⅶ
• Ⅰ. Introduction = 1
• Ⅱ. Materials and Methods = 4
• 1. Construction of the expression vector pET SUMO-KML-B1 = 4
• 2. Expression and purification of rKML-A1 = 4
• 3. Expression of rKML-B1 in E. coli = 5
• 4. Purification of rKML-B1 = 5
• 5. Dialysis of rKML-B1 = 6
• 6. Immunoblot Analysis = 7
• 7. Endotoxin Removal = 7
• 8. RIP Assay (In Vitro Transcription/Translation) = 8
• 9. Carbohydrate Binding Assay = 8
• 10. Cytotoxicity Assay = 9
• Ⅲ. Results = 11
• 1. Construction of the expression vector pET SUMO-KML-B1 = 11
• 2. Gene expression of rKML-B1 = 13
• 3. Purification of the expressed rKML-B1 = 16
• 3.1. Determination of binding condition = 16
• 3.2. Determination of washing condition = 18
• 3.3. Immunoblot analysis = 21
• 3.4. Cleavage of SUMO fusion protein = 23
• 4. Biological activity of rKML-A1 = 25
• 4.1. Ribosome inhibition activity of rKML-A1 = 25
• 4.2. Cytotoxicity of rKML-A1 = 27
• Ⅳ. Discussion = 29
• Ⅴ. References = 32
• Acknowledgement = 49