Carbon monoxide inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis by suppressing NF-κB-dependent NFATc1 expression : 일산화탄소(CO)에 의한 파골세포 분화 조절 기전 연구: RANKL에 의한 NF-κB 활성화 및 NFATc1의 발현 억제

국문 초록 (Abstract)

RANKL에 의한 신호전달은 대식세포가 파골세포로 분화하는데 필수적이다. 일산화탄소(CO)는 헴산화효소에 의해 헴이 분해되는 과정에서 생성되는 내생적인 기체 분자이며 항염증과 항산화 효과를 가지고 있다. 최근 이 분자는 류마티스 관절염이 걸린 생쥐에서 항염증 기전을 보였지만 파골세포의 분화에서 어떠한 조절을 하는지에 대해서는 아직까지도 명확하게 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 CO를 방출하는 화학분자인 COMR-2가 RANKL에 의해 파골세포 분화에 미치는 효과와 작용기전에 대한 연구를 수행하였다. RANKL로 자극한 대식세포는 파골세포로 분화되었고 뼈의 흡수가 효과적으로 일어났다. 이러한 파골세포의 분화와 뼈의 흡수는 CORM-2의 전 처리에 의해 유의성 있게 저해되었다. 또한 CORM-2는 파골세포에서 특이적으로 발현되는 tartrate resistant acid phosphatase, cathepsin K, osteoclast-associated receptor의 발현이 저해 하였다. 뿐만 아니라, 이들 유전자의 발현에 핵심적인 전사인자인 NFATc1의 발현도 저해되었다. CORM-2는 NF-κB의 활성화와 관련된 IKK 인산화 및 IkBα의 인산화와 분해, 그리고 NF-κB가 세포질로부터 핵으로의 이동 등을 효과적으로 억제하였다. 더 나아가서 CORM-2는 RANKL에 의해 유도되는 NFATc1의 전사조절 부위인 프로모터에 NF-κB가 결합되는 것을 효과적으로 억제하였다. 이러한 연구결과는 CO에 의한 파골세포 분화억제 효과는 RANKL에 의해 유도되는 IKK의 활성화, NF-κB의 핵이동, NFATc1의 발현, 파골세포 표지인자 발현 등을 효과적으로 억제함에 기인됨을 시사하고 있다. 따라서 CO는 파골세포분화로 유발되는 골다공증 및 염증성 관절염 치료제로 활용될 수 있음을 제시하고 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Signaling by receptor activator of NF-κB (nuclear factor-κB) ligand (RANKL) is essential for differentiation of macrophages into osteoclasts. Carbon monoxide (CO), an endogenous gas molecule from breakdown of heme by hemeoxygenase, has been known to mediate anti-inflammatory and anti-oxidant effects. Recently, this molecule showed to mediate anti-inflammatory effects in a rheumatoid arthritis mouse model. However, the regulatory effects of CO on osteoclastogenesis have not been clearly elucidated. We here investigated the effects of CO on RANKL-induced osteoclastogenesis using the CO-releasing molecule CORM-2. We found that treatment of CORM-2 inhibited RANKL-induced differentiation of macrophages into osteoclasts and subsequent bone resorption. CORM-2 also decreased RANKL-induced expression of tartrate resistant acid phosphatase, cathepsin K, and osteoclast-associated receptor, which are well-known marker genes for osteoclasts. Moreover, CORM-2 inhibited the RANKL-induced expression of nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 (NFATc1), which a key transcription factor of osteoclastogenesis. During the RANK/RANKL signaling, CORM-2 inhibited nuclear translocation of NF-κB p65 subunit, which was correlated with its inhibitory effect on IκB kinase (IKK) phosphorylation and IκBα phosphorylation and degradation, but not ERK, p38, JNK and AKT. Furthermore, CORM-2 decreased RANKL-mediated bind of NF-κB to the promoter region of NFATc1, indicating that CO blocks NFATc1 expression via inhibition of IKK activation. These data suggest that CO inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis of cultured macrophages by IKK-dependent NF-κB-mediated osteoclastogenic signaling. Our results suggest that CO has the potential for treatment of inflammatory arthritis.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 7
• 1. Materials 7
• 2. Cell culture 7
• 3. Osteoclast differentiation and TRAP Staining 8
• 4. Pit formation assay 9
• 5. Western blot analysis 9
• 6. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 10
• 7. Preparation of nuclear extracts 11
• 8. Localization of NF-κB p65 subunit 12
• 9. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay 12
• 10. Statistical analysis 13
• Ⅲ. RESULTS 14
• 1. Effects of CO, iron, and bilirubin on RANKL-induced
• osteoclastogenesis 14
• 2. Effects of CO on RANKL-induced osteoclast differentiation and bone resorption in BMMs 16
• 3. CO suppresses RANKL-induced osteoclast marker gene expression 18
• 4. CO inhibits RANKL-induced NFATc1 expression 20
• 5. CO inhibits RANKL-induced NF-κB signal pathway, but not MAPK and AKT pathway 22
• 6. CO reduces RANKL-induced nuclear translocation of NF-κB 24
• Ⅳ. DISCUSSION 28
• Ⅴ. REFERENCES 33
• ABSTRACT (in Korean) 44