3T3-L1 지방전구세포에서 DNAJC6 과잉 및 억제 현상이 지질대사와 인슐린 신호에 미치는 영향 = Effects of DNAJC6 overexpression and inhibition on lipid metabolism and insulin signaling in 3T3-L1 cells.

국문 초록 (Abstract)

국내 비만 유병률은 해마다 증가하고 있으며, 특히 소아청소년기의 비만은 조기 성인병 발병의 위험성이 높으므로 소아청소년 비만의 예방 및 관리는 매우 중요하다. 비만의 원인은 에너지 섭취와 소비의 불균형으로 알려져 있으나 에너지 불균형과 관련된 유전자 추적 및 기전 규명 연구는 거의 없다. 본 연구실에서는 소아비만 코호트를 기반으로 유전체 연구(GWAS)에서휴지기 대사량(RMR)과 비만(BMI)과의 연관성에 유의적인 상관성을 보이는 유전자 DNAJC6를 도출하였다. DNAJC6 유전자 변이가 신경 퇴행성 질환(파킨슨병)과 관련이 있고, 전사자리를 공유하는 LEPR promotor와의 유전자 결손이 소아 비만을 유발시키며, DNAJC6가 암호화한 auxilin이 transferrin, GLUT4 등 endocytosis 기능을 억제한다는 연구가 발표된 바 있다. 그러나 아직까지 DNAJC6의 유전자 발현 차이가 adipogenesis 혹은 thermogenesis에 미치는 영향에 관한 기전 연구가 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 연구의 목적은 3T3-L1 지방전구세포에 DNAJC6 유전자를 과발현(over-expression, Tg+ 군) 혹은 억제(siRNA, Tg- 군)했을 때 지방세포의 생리학적 기전의 변화를 확인하는 것이다.
DNAJC6 유전자를 과발현 혹은 억제한 3T3-L1 preadipocyte의 adipocyte 분화 과정에서의 생리적 기전을 확인하기 위한 실험 분석을 수행하였다. 3T3-L1 세포에 DNAJC6 유전자를 과발현하거나 억제할 때 사용되는 항생제 농도와 transfection reagent 농도를 결정하기 위해 세포생존율 실험을 하였으며, RT-PCR과 western blotting analysis로 DNAJC6 유전자 발현을 확인하였다. 지질 축적 및 세포 핵 손상 정도(DAPI/BODIPY staining, Oil Red O staining), 지질 분해(TG/free glycerol excretion), 지질 합성 및 분해 관련 인자, adipocytokines 인자, insulin-GLUT4 cascade signals 인자(Western blotting analysis), 미토콘드리아 기능(mitochondria stress test) 등 생리적 기전을 대조군과 비교 분석하였다.
3T3-L1 세포에서 DNAJC6 유전자를 과발현 할 때 분화 8일차에서 DAPI/BODIPY staining과 Oil Red O staining에서 지방구 염색이 되지 않았고, adipogenesis 인자인 PPARγ , C/EBPα, aP2 발현이 대조군 분화 8일차 대비 Tg+ 분화 8일차에서 78.18%, 89.76%, 99.52% 유의적으로 감소하였으며, preadipocyte 인자인 Pref-1 발현이 2.45배 유의적으로 증가하였다. 또한 lipolysis 인자인 pHSL(Ser563), HSL 발현이 대조군 분화 8일차 대비 Tg+ 분화 8일차에서 73.53%, 88.10% 유의적으로 감소하였으며, 세포 배양액에서 TG와 free glycerol 농도가 72.19%, 90.84% 감소하였다. 지방 세포에서 분비하는 아디포사이토카인인 LEPR, leptin, adiponectin 발현이 대조군 분화 8일차 대비 Tg+ 분화 8일차에 98.55%, 79.83%, 99.94% 유의적으로 감소하였다. 인슐린-GLUT4 신호체계인 insulin receptor β , pIRS(Ser307), pAkt(Thr308), AS160, GLUT4의 발현이 순차적으로 억제되었다. 세포 내 에너지 결핍 상태에서 Akt의 다른 downstream인 mTOR 활성이 Tg+ 세포에서 대조군 대비 억제되며 autophagy 인자인 LC3Ⅱ 발현이 유의적으로 증가하는 조절작용이 있음을 확인하였다. 미토콘드리아 기능 바이오마커인 PGC1α와 UCP1 발현이 대조군 8일차 대비 78.31%, 31.99% 감소하였으며, 미토콘드리아의 산소 소비량과 ATP 생산량이 대조군에 비해 유의적으로 낮았다.
3T3-L1 세포에서 DNAJC6 유전자를 억제 할 때 분화 4일차에서 DAPI/BODIPY staining에서 지방구가 대조군에 비해 강하게 염색되었으며, Oil Red O staining에서 흡광도 값이 대조군에 비해 1.18배 높았다. 그리고 분화 8일차에서 leptin, insulin receptor β, GLUT4 발현이 대조군과 유의적인 차이가 나지 않았다. 미토콘드리아 기능 인자인 UCP1 활성도 지방세포로의 분화 시에 대조군과 비슷한 발현 양상을 보였다. 그러나 미토콘드리아의 최대호흡량과 예비호흡용량이 대조군 대비 48.97%, 243.28% 유의적으로 감소하였다.
결론적으로 DNAJC6 유전자가 과발현된 3T3-L1 세포는 지방 합성과 분해, 아디포사이토카인 발현, 인슐린-GLUT4 신호체계가 억제되며 미토콘드리아 증식 및 기능 등이 억제되었다. DNAJC6 유전자가 억제된 3T3-L1 세포는 대조군에 비하여 분화 중반부에 높은 지방 합성을 보이고, adipocyte 상태에서 정상적인 인슐린-GLUT4 체계를 보이며 UCP1 활성도 대조군과 비슷한 증가 양상을 보였다.
본 연구는 DNAJC6 유전자를 과발현하거나 억제한 3T3-L1 세포로 실험을 진행하였다. DNAJC6 유전자 억제 효과는 분화 중반부(분화 4일차)부터 증가함에 따라 지방세포의 대사가 빠르게 나타날 것이므로 향후 이를 기준으로 추가실험이 필요하다. 또한 DNAJC6 유전자 과발현 혹은 억제 transgenic mice를 대상으로 기관 간 상호기전을 규명할 필요가 있다. 그러나 본 연구는 에너지불균형과 관련된 유전자인 DNAJC6 발현의 차이가 지방세포의 대사를 조절하는 기전을 확인하였으므로, 향후 에너지 불균형에 따른 비만연구와 관련된 전임상(in vivo) 및 임상(clinics)연구를 위한 기초자료로 이용될 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The prevalence of obesity in Korea is increasing every year. In particular, obesity in children and adolescents is at high risk of developing early-onset adult diseases, so prevention and management of obesity are essential. The cause of obesity is known as an imbalance in energy intake and consumption, but few studies have been conducted on gene tracking and mechanism identification related to energy imbalance. In this lab, we derive gene DNAJC6 that shows a significant correlation between resting metabolic rate(RMR) and obesity(BMI) in genomic studies(GWAS) based on childhood obesity cohort. Studies have been published that DNAJC6 gene mutation is related to neurodegenerative diseases(Parkinson’s disease), gene deficits with LEPR promoters that share transcription sites cause childhood obesity, and auxilin encoded by DNAJC6 inhibits endocytosis functions such as transferrin and GLUT4. However, no mechanical studies have been conducted on the effect of gene expression differences in DNAJC6 on adipogenesis or thermogenesis. Therefore, this study aims to confirm the change in the physiological mechanism of adipocytes when the DNAJC6 gene is overexpressed(Tg+) or inhibited(Tg-) in 3T3-L1 preadipocyte cells.
The experiment conducted an experimental analysis to confirm the physiological mechanism in the adipocyte differentiation process of 3T3-L1 preadipocyte in which DNAJC6 was overexpressed or inhibited. Cell survival rates were confirmed to determine the antibiotic and transfection reagent concentration in 3T3-L1 cells was confirmed when DNAJC6 was overexpressed and inhibited, and DNAJC6 gene expression was confirmed at the level of mRNA and protein. Physiological mechanisms such as lipid accumulation and cell nuclear damage(DAPI/BODIPY staining, Oil Red O staining), lipid degradation(TG/free glycerol extraction), adipogenesis and lipolysis, adipocytokines, insulin-GLUT4 signals related protein expression(western blotting analysis), mitochondrial function(mitochondria stress test) were compared and analyzed with the control group.
When the DNAJC6 gene was overexpressed in 3T3-L1 cells, lipid staining was not stained in DAPI/BODIPY staining and Oil Red O staining at day 8 of differentiation, and the expression of PPARγ, C/EBPα, and aP2 of the adipogenesis factors was significantly reduced by 78.18%, 89.76%, and 99.52% on the day 8 of Tg+ compared to day 8 of control. Futhermore, Pref-1 expression of the preadipocyte factor was significantly increased by 2.45times. in addition, the expression of pHSL(Ser563) and HSL of lipolysis factors was significantly reduced by 73.53% and 88.10% on day 8 of Tg+ compared to day 8 of control, and TG and free glycerol concentrations in cell culture medium were decreased by 72.19% and 90.84%. The expression of LEPR, leptin, and adiponectin of adipocytokines was significantly reduced by 98.55%, 79.83%, and 99.94% on day 8 of Tg+ compared to day 8 of control. The expression of insulin-GLUT4 signaling systems(insulin receptor β, pIRS1(Ser307), pAkt(Thr308), AS160, and GLUT4) was sequentially suppressed. In the state of intracellular energy deficiency, it was confirmed that the mTOR activity, another downstream of Akt, was suppressed on the Tg+ cells compared to the control, and there was a regulatory action that significantly increased the expression of LC3Ⅱ, an autophagy factor. The expression of PGC1α and UCP1, which are mitochondrial functional biomarkers, decreased 78.31% and 31.99% on day 8 of Tg+ compared to day 8 of control, and the oxygen consumption and ATP production of mitochondria were significantly lower than of the control group.
When inhibiting the DNAJC6 gene in 3T3-L1 cells, adipocytes were stained strongly in DAPI/BODIPY staining at day 4 of differentiation, and absorbance values in Oil Red O staining were 1.18 times higher than the control. And on day 8 of differentiation, there was no significant difference in leptin, insulin receptor β, and GLUT4 expression compared to the control. The UCP1 activity also showed a similar expression to the control group when differentiated into adipocytes. However, mitochondria’s maximal respiratory and spare respiratory capacity was significantly reduced by 48.97% and 243.28% compared to the control group.
In conclusion, overexpression of the DNAJC6 gene in 3T3-L1 cells inhibited glucose inflow into 3T3-L1 cells, inhibiting adipogenesis and degradation, adipocytokines expression, insulin-GLUT4 signaling system, and mitochondrial proliferation and function at day 8 of differentiation. Inhibition of the DNAJC6 gene showed higher adipogenesis than the control group in the middle of differentiation. In addition, Tg- on day 8 of differentiation, the normal insulin-GLUT4 system was shown, and the UCP1 activity was similar to the control group.
This study experimented with 3T3-L1 cells that overexpressed or inhibited the DNAJC6 gene. As the DNAJC6 gene inhibition effect increases from the middle of differentiation(day 4 of differentiation), the metabolism of fat cells will appear quickly, so additional experiments are needed based on this in the future. In addition, it is necessary to identify inter-organizational mechanisms targeting DNAJC6 gene overexpression or inhibition transgenics. However, since this study identified the mechanism by which differences in DNAJC6 gene expression, a gene related to energy imbalance, control the metabolism of fat cells, it can be used as basic data for in vivo and clinical studies related to obesity studies.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. 비만 발생 후보 유전자 1
• 2. DnaJ family group and DNAJC6 gene 3
• 3. 3T3-L1 지방전구세포의 adipogenesis 과정 6
• 3-1. Adipogenesis 6
• 3-2. Insulin-GLUT4 cascade system 7
• 3-3. Adipocytokines 8
• 4. 미토콘드리아 기능 10
• 5. 연구목적 11
• Ⅱ. 재료 및 방법 12
• 1. 3T3-L1 세포배양 및 분화 12
• 2. 세포독성평가 (Cell viability assay) 13
• 3. 형질주입 (Transfection) 13
• 3-1. 과발현 (Overexpression) 13
• 3-2. 억제 (Inhibition) 14
• 4. DAPI/BODIPY staining 14
• 5. Oil Red O staining 15
• 6. Free glycerol 및 triglyceride 측정 16
• 6-1. Free glycerol 측정 16
• 6-2. Triglyceride 측정 17
• 7. RT-PCR 17
• 8. Western Blotting analysis 18
• 9. Mitochondrial function test 21
• 9-1. 산소소비량을 활용한 미토콘드리아 스트레스 측정 원리 21
• 9-2. 실험 방법 21
• 10. Statistical analysis 24
• Ⅲ. 결과 및 고찰 25
• 1. DNAJC6 transfection의 안전성 확인 (세포 생존율) 25
• 2. DNAJC6 gene overexpression 및 inhibition 확인 27
• 3. DAPI/BODIPY staining 29
• 4. 지방구 형성 (Oil Red O 염색) 31
• 5. 지방합성 (Adipogenesis) 및 지방분해 (Lipolysis) 관련 단백질 발현 33
• 6. Tg- & Tg+ 세포에서의 TG 및 free glycerol 분비 35
• 7. 비만세포 관련 사이토카인 (Adipocytokines) 발현 37
• 8. Insulin-GLUT4 신호체계 39
• 8-1. DNAJC6 과발현의 영향 39
• 8-2. DNAJC6 억제시 Leptin-인슐린-GLUT4 체계 41
• 8-3. DNAJC6 과발현 혹은 억제시 Autophagy 41
• 9. Mitochondrial function 44
• 9-1. PGC-1α와 UCP1 발현 44
• 9-2. 산소소비량 및 ATP 생성 46
• Ⅳ. 요약 및 결론 50