당뇨 모델 췌장도의 증식 관여 단백질에 대한 연구 = Proliferation associated proteins in the pancreatic islet of the diabetic models

국문 초록 (Abstract)

본 실험에서는 여러 가지 당뇨병의 모델로부터 췌장세포의 증식을 일으키는 현상을 기초로 하여 이 증식현상에 관여하는 단백질을 확인하고 역할을 밝히고자 하였다. 이를 위하여 streptozotocin으로 흰쥐에 당뇨를 유발해 세포의 증식을 유도하였고, β세포의 증식 현상을 보이는 NIDDM 모델인 KKA^(y), db/db mouse의 췌장을 β세포의 결손이 있는 NOD mouse와 비교, 분석하였다. 이와 같은 실험을 통하여 증식 형태, 증식세포의 종류, 이때 발현되는 단백질의 변화 등을 면역세포화학법, in-situ hybridization 등의 조직학적인 방법과 northern blot, western blot 등의 분자 생물학적인 방법으로 비교 관찰하였다.
본 실험의 결과에 의하면, streptozotocin을 주입한 흰쥐의 췌장 islet는 1 주일이 지나면서 세포의 증식 현상을 관찰할 수 있었고, 이 때 증식되는 세포의 종류는 glucagon을 분비하는 α세포이었다. 또한, 이때 증식되는 α세포에서는 glucagon과 더불어 clusterin, B/K 단백질이 발현되었으며 당뇨가 진행되어 혈당이 올라갈수록 이들 단백질의 발현양도 증가하는 양상을 보였다. Northern blot의 결과 clusterin은 streptozotocin을 투여하면 즉각적으로 증가되는 반면 B/K는 α세포의 증식이 일어난 후에 다량 발현되었다. KKA^(y) mouse의 췌장 islet에서는 β세포의 증식이 나타나지만 clusterin과 B/K를 분비하는 세포는 α세포이었고 이 α세포는 islet 전체에 산재된 모습으로 존재하여 B/K 단백질을 발현하였다. 반면, 비만 당뇨쥐인 db/db mouse islet의 α세포는 clusterin과 B/K를 모두 많이 발현하였다. 이와 같은 실험 결과로 볼 때 clusterin은 외부 자극에 대하여 세포를 보호하는 역할을 하며, B/K는 조직의 세포를 재구성하는 요소로써 작용한다고 생각된다.
따라서 본 연구자는 이 단백질들이 특이하게 증식되는 α세포에서만 발현되어지는 점으로 보아 이들의 조절은 당뇨병의 치료에 기초가 될 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Destruction of. the pancreatic β-cells results in a kind of diabetes. Recently, it has been reported that clusterin involved tissue reorganization not only during embryonic development but also in damaged tissues. Therefore, islet β-cell proliferation may be crucial for the diabetic patients.
The aim of this work was designed to determine the islet cell proliferation, and to describe the function of the molecules associated proliferation. In the present study, we have observed that islet cell population increases in the various diabetic models including streptozotocin induced diabetic model, NOD, KKA^(y), db/db mice. Therefore, we attempted to find the protein molecules in these diabetic animal models. Although, B/K, expressed in the islet, which was first recognized in the selected regions of the brain and kidney. However, the roles of B/K both in the brain and in the kidney has not been elucidated yet.
In order to induce islet cell proliferation, we injected streptozotocin into the rat jugular vein. At 12-24 hr after treatment, islet cell death was evident with karyolysis and dissociation of the intracellular junctions in most β-cells. At 72 hr after streptozotocin treatment, however, the remaining cells showed a normal appearance and began to proliferate. From this time on, the volume of the islets gradually increased. In those streptozotocin treated animals, the proliferating cells were fumed out to be α-cells and expressed clusterin as well as B/K together with glucagon. Double immunolabeling showed co-localization of clusterin, B/K and glucagon in the same secretory granules of the cells. Clusterin and B/K were also strongly detected in the pancreatic islets of the NIDDM animal (KKA^(y), db/db) showing the islet cell proliferation. These results imply that the proteins play the important roles in cell protection as well as cell proliferation or tissue remodeling The expressions of clusterin and B/K mRNA were examined by the northern blot analysis. While the levels of clusterin mRNA in the rat pancreas were steadily increased from 1 hr after streptozotocin treatment, B/K mRNA was significantly increased at 14 day following streptozotocin injection. It suggests that both clusterin and B/K proteins may function as the molecules of the cell protection and cell proliferation leading to tissue remodeling. However, clusterin might be rather associated with cell protection than cell proliferation while the Bht takes mainly part in cell proliferation.
We concluded that the protein, clusterin and B/K play the important roles in proliferation of α-cell, but not in β-cell growth. Therefore, it could be suggested that the regulation of the α-cell proliferation by depleting the proteins may induced the environment for β-cell growth.

목차 (Table of Contents)

• 요약 = ⅰ
• Abstract = ⅲ
• 목차 = ⅵ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 실험 재료 및 방법 = 6
• 1. 실험동물 = 6
• 2. 조직의 고정 및 표본제작 = 6
• 2.1. 광학현미경 시료 = 6
• 2.2. 투과전자현미경 시료 = 7
• 3. 면역세포화학법 = 7
• 4. Immunogold 표지법 = 8
• 5. Probe preparation = 8
• 6. In-situ hybridization = 9
• 6.1. 전처리과정 = 9
• 6.2. Prehybridization 및 hybridization = 10
• 6.3. Post-hybridization = 10
• 7. 대조실험 = 11
• 8. Northern blot analysis = 11
• 8.1. RNA 분리, 전기영동 및 transfer = 11
• 8.2. Prehybridization 및 hybridization = 12
• 9. Western blot = 13
• Ⅲ. 결과 = 14
• 1. Streptozotocin 투여된 당뇨모델 = 14
• 1.1. 혈당농도변화 = 14
• 1.2. 대조실험 = 14
• 1.3. Clusterin과 B/K의 분비세포의 동정 및 변화 = 14
• 1.4. Clusterin과 B/K 발현양의 변화 = 16
• 2. NOD mouse 모델 = 16
• 3. KKA^(y) mouse 모델 = 17
• 4. db/db mouse 모델 = 18
• Ⅳ. 고찰 = 25
• Ⅴ. 참고문헌 = 30