고정조건에 따른 조직슬라이드의 염색성 및 DNA보존성 연구

국문 초록 (Abstract)

병리과의 조직병리검사에서 진단까지의 과정 중 가장 초기단계이자 기본이 되는 과정은 고정이다. 고정은 진단을 위해 생체로부터 떼어낸 조직을 생체와 같은 구조로 유지하기 위해 실행하는 과정이다. 고정에는 영향을 미치는 여러가지 요인이 있다. 조직의 종류의 따른 특성, 고정의 시간, 온도, pH 등이 이에 해당한다. 따라서 본 논문에서는 이러한 요인들 중 조직 종류, 시간과 온도에 변화를 주어 고정을 진행하고, 각 조건에 따른 염색성과 DNA 보존성을 평가하여 고정의 조건이 검사에 어떠한 영향을 미치며 어떠한 인자의 영향이 더 큰지 확인해 보고자 시행하였다.
고정은 4℃(냉장), 25℃(실온), 50℃(Oven)에서 각각 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간 진행하였고 24시간은 과고정 상태를 확인하기 위해 설정하였다. 조직의 종류는 특성에 따라 실질장기와 점막층을 포함하고 있는 장관조직으로 선정하였다. 실질장기로는 Liver를 장관조직에는 Colon과 Small intestine을 함께 사용하였다.
염색성 평가는 Hematoxylin-Eosin(HE) 염색과 각 장기의 특성에 맞는 특수염색을 종합하여 평가하였다. 특수염색으로 Liver는 Reticulin염색, Intestine은 Periodic-Acid-Schiff (PAS)염색을 시행하였으며 Liver의 조직형태학적 변화와 염색성, 장관조직의 Mucosal change, Proper muscle layer degeneration와 염색성을 확인하였다.
DNA 보존성 평가는 DNA Purity측정 후 안정성 확인을 위해 DNA Integrity Number(DIN)를 평가하였다.
그 결과 염색성 평가의 경우 Liver는 현미경 하에서 조직형태학적 차이는 관찰되지는 않았으며, 모든 온도에서 시간이 길수록 염색성이 진해지는 경향을 보였다. Intestine은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 Mucosal change, Proper muscle layer degeneration의 정도가 적었으며, PAS염색성이 진해지는 경향을 보였다.
DNA보존성평가는 Liver의 경우 Purity의 차이는 거의 없었으며 DIN값은 모든 온도에서 가장 오랜 시간 고정한 조건에서 가장 낮은 값을 나타냈다. Intestine은 Purity의 차이는 거의 없었으며 DIN값은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 DIN값이 낮아졌다. 유의한 차이는 25℃과 50℃에서 확인되었다. 이는 4℃에서의 고정이 DNA가 가장 안전하게 고정됨을 의미한다.
본 실험 통해 고정은 염색성과 DNA보존성 모두에서 시간과 온도조건 중 시간의 영향이 더 있음을 확인할 수 있었고, 점막을 포함하고 있는 조직이 고정조건에 더 민감하며, 4℃에서 DNA가 안정하게 고정되는 것으로 평가되었다. 본 연구 결과는 향후 조직병리 검사의목적이나 진단을 위한 고정조건설정에 관한 연구에 기초적인 자료로 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The initial and basic process of histopathology examination to diagnosis in pathology is fixation. Fixation is the process of keeping tissues removed from the living body in the same structure as the living body for diagnosis. There are several factors that affect fixation. These factors are type of tissue, time of fixation, temperature, pH of fixation solution, and etc.
Therefore, in this paper, among these factors, fixation was performed by changing tissue type, time, temperature, stainability, and DNA conservation according to each condition were evaluated to determine how the fixation condition affects the test and which factor is more affected. Tissue samples were fixed for 1hrs, 2hrs, 4hrs, 8hrs, and 24hrs, and at temperature of 4℃, 25℃, and 50℃. 24hrs fixing time was set to check the over-fixed condition. The type of tissue was selected as a spectacular tissue containing a parenchymal organ, Liver, and a mucosal layer, according to its characteristics. The Intestine included Colon and Small intestine.
The stainability was evaluated using HE stain and special dyeing suitable for the characteristics of each organ. For special dyeing, Reticulin staining was used for Liver and PAS staining was used for Intestine. Each stainability was assessed by histological change for liver, and mucosal change and Proper muscle layer degeneration for intestine. DNA integrity number was evaluated to confirm stability after DNA Purity measurement. As a result, no histo-morphological difference was observed in the stainability of liver, and the stainability tended to intensify as time increased at all temperatures. There was little difference in Purity in DNA conservation, and the DIN value was the lowest at all temperatures under the longest fixed conditions. Neither chromatin nor DNA conservation showed significant differences. Intestine staining tended to have less degree of mucosal change and professional muscle layer generation as fixed times increased at all temperatures and to have higher staining properties 25℃. DNA conservation had little difference in Purity, and the DIN value decreased as the fixation time increased at all temperatures. Significant differences were identified at room temperature and Oven.
This experiment confirmed that fixation had more time effects among time and temperature conditions in both staining and DNA conservation properties 25℃, and that tissues containing mucous membranes were more sensitive to fixed conditions, and DNA was evaluated to be stably fixed at 4℃.
The results of this study are expected to contribute as basic data for future research on the purpose of histopathological examination or the setting of fixed conditions for diagnosis.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• I. 서 론 1
• II. 재료 및 방법 5
• 1. 검체선정 및 절취 5
• 2. 고정 6
• 3. 침투력 측정 7
• 4. 블록 및 조직표본 제작 8
• 5. 염색 13
• 6. 염색성 평가 19
• 7. DNA 추출 및 완전성평가 21
• 7-1 DNA 추출 21
• 7-2 DNA 완전성 평가 22
• 8. 통계분석 23
• III. 결 과 24
• 1. 침투력 측정... 24
• 2. 염색성 평가 26
• 2-1. Liver의 염색성 평가 26
• 2-2. Intestine의 염색성 평가 29
• 3. DNA 보존성 평가 34
• 3-1. DNA purity 34
• 3-2. DNA 완전성평가 37
• IV. 고 찰 41
• Ⅴ. 결 론 46
• Ⅵ. 참고문헌 47
• Abstract 51