인삼잎 유래의 보체계 활성화 다당의 정제 및 제반 특성

국문 초록 (Abstract)

인삼 재배농가에서 특별한 이용 방안의 모색 없이 대부분 폐기되고 있는 인삼잎은 대상으로 인체의 생체방어 기증 중 체액성 면역계에서 중요한 기능을 담당하고 있는 보체계(complement system)의 활성화능을 검토하였다. 인삼잎의 열수 추출물로부터 조제한 수용성 조다당 획분인 GS-1의 경우 1000㎍/㎖의 농도에서 80% 이상의 높은 보체계의 활성화능을 보였으며 활성은 GS-1의 농도에 의존적인 경향을 나타났다. 이 후 GS-1의 획분은 Cetavlon 처리에 의해 전기적 성질이 상이한 3개의 획분, GS-2, GS-3 및 GS-4로 분획 하였으며 이들 분획중 GS-4가 가장 높은 항보체 활성과 수율을 나타냈다. 한편 GS-4가 가지는 항보체 활성의 활성 본체를 규명하기 위해 protease 가수분해, periodate 산화, chlorite 및 polymyxin B 처리를 행하여 활성을 비교한 결과 GS-4의 항보체 활성은 protease, chlorite 및 polymyxin B 처리에 의해 큰 영향을 받지 않은 반면 periodate 산화에 의해서는 급격한 활성의 저하가 관찰되어 GS-4중 주로 다당 부위가 활성에 관여함을 알 수 있었다. GS-4는 DEAE-Sepharose FF(Cl^(-) form) 과 Biogel P-30, p-100으로 연속적인 정제를 실시한 결과 활성과 수율이 우수한 GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia 및 GS-4c-IIb의 정제다당을 얻을 수 있었다. 이들은 HPLC상에서 좌우대칭의 단일 peak 경향을 보였으며 분자량은 각각 14,400, 31,000, 71,000 및 81,000 Da 임을 확인할 수 있었다. 이들 고활성 획분(GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia 및 GS-4c-IIb)의 화학조성을 분석한 결과 중성당이 약 60%, 산성당 함량이 35%이고, protein을 검출되지 않았으며, 약간의 KDO (2.5∼5.4%)가 검출되었다. 구성당 분석의 결과 4개의 다당 모두 arabinose (13.6∼22.5)와 galactose(15.3∼34.8)가 높은 비율로 존재하였으며 소량의 rhamnose, fucose, xylose, mannose 및 glucose가 검출되었다. 이들의 보체계 활성화 양식의 경우 anti-human C_(3)를 이용한 2차적 전기영동 및 Ca^(++) 또는 Mg^(++)이온 존재하에서 ITCH_(50) 값을 비교한 결과 4개 정제다당들은 모두 classical pathway와 alternative pathway 두경로를 모두 활성화시킴을 알 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The roots of Panax ginseng C.A. Meyer are a well known Chinese drug widely used clinically in oriental countries. The roots of P. ginseng are valuable because it takes 4∼6 years for their harvest, whereas the leaves can be harvested every year. If any materials from the leaves have a similar or new pharmacological activity as those from the roots, they will be available as well as the roots and their utility values as neutraceuticals will be enhanced. Therefore, in this study, the leaves of P. ginseng were examined for their abilities to activate the complement system which plays important roles in host defense system.
A water soluble crude of polysaccharide fraction (GS-1) with anti-complementary activity has been isolated from the hot water extract of the leaves of P. ginseng C.A. Meyer. GS-1 showed relatively potent anti-complementary activity (ITCH_(50), more than 80% at 1000 ㎕/㎖) in a dose-dependent fashion. And then, GS-1 was fractionated by Cetavlon treatment to give the three fractions such as GS-2, GS-3 and GS-4. Of these fractions, GS-4 showed the highest anti-complementary activity and yield. In order to elucidate the real active moiety in GS-4, GS-4 was digested with protease and treated with periodate, chlorite and polymyxin B. The anti-complementary activity of GS-4 was not affected by protease, chlorite and polymyxin B treatment, however, markedly decreased by periodate oxidation. These results suggest that the complement activation by GS-4 is mainly due to polysaccharide moiety.
The active fraction GS-4 was successively purified by open column chromatographies on DEAE-Sepharose FF (Cl^(-) form), Biogel P-30 and Biogel P-100 to give the four purified polysaccharides, GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia and GS-4c-IIb which showed higher activities and yields. GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4a-Ia and GS-4c-IIb were eluted as almost single HPLC peaks, and their molecular weights were estimated to be 14,400, 31,000, 71,000 and 81,000 Da, respectively. These active polysaccharides showed similar monosaccharide compositions, which contained significant portion of arabinose (13.6∼22.5%), galactose (15.3∼34.8%) and uronic acid (30.4∼39.2%) in addition to the small portion of rhamnose, fucose, xylose, mannose and glucose. Particularly the molar ratios of galactose and arabinose in the active polysaccharides were almost same (1.1∼1.8). When the cross-immunoelectrophoresis with anti-human C3 serum was carried out after incubation of normal human serum with the active polysaccharides in Ca^(++)-free condition, cleavages of C3 precipitation lines were observed. Also the anti-complementary activities of the active polysaccharides were considerably retained in the absence of Ca^(++)ion. These results suggest that the mode of complement activation by the four active polysaccharides from P. ginseng C.A. Meyer can be via the alternative pathway as well as the classical pathway.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = i
• 표목차 = iv
• 도목차 = v
• 논문개요 = viii
• I. 서론 = 1
• II. 실험 재료 = 7
• 1. 재료 = 7
• 2. 시약 = 7
• 3. 완충용액 = 7
• 4. Resin = 8
• III. 실험 방법 = 9
• 1. 보체계 활성화 물질의 선별 = 9
• 1.1. 용매별 추출물 조제 = 9
• 1.2. 단계적 계통 추출물 조제 = 9
• 2. 항보체 활성 조다당의 추출 = 9
• 3. 일반 분석 = 11
• 4. 구성당 분석 = 11
• 5. 항보체 활성 측정 = 13
• 5.1. 정상인 혈청 (Normal human serum, NHS) 의 제조 = 13
• 5.2. 항보체 활성의 측정 = 13
• 6. 항보체 활성 본질 규명 = 15
• 6.1. Protease digestion = 15
• 6.2. Periodate oxidation = 15
• 6.3. Chlorite treatment = 17
• 6.4. Polymyxin B sulfate treatment = 17
• 7. 보체계 활성화 경로 검토 = 17
• 7.1. 교차 면역 전기 영동 (Cross-immunoelectrophoresis) = 17
• 7.2. 항보체 활성의 측정 = 18
• 8. 보체계 활성화 다당의 분리 및 정제 = 18
• 8.1. Cetavlon 처리에 의한 중성 다당의 분리 = 18
• 8.2. Anion exchange chromatography = 18
• 8.3. Gel permeation chromatography = 20
• 8.4. HPLC에 의한 분자량 측정 및 순도 확인 = 20
• IV. 결과 및 고찰 = 23
• 1. 인삼잎의 산지별 항보체 활성 검토 = 23
• 2. 추출 용매별 항보체 활성 검색 = 23
• 3. 인삼잎으로부터 열수추출 고분자 획분의 조제 및 활성 측정 = 26
• 4. Cetavlon 처리에 의한 항보체 활성 물질의 분획 = 28
• 5. GS-4 획분의 보체계 활성 본체의 검토 = 32
• 6. 보체계 활성 다당의 분리 및 정제 = 35
• 6.1. Anion exchange chromatography = 35
• 6.2. Gel permeation chromatography = 35
• 6.3. 정제 다당의 순도 및 분자량 확인 = 41
• 7. GS-4 획분의 보체계 활성화 작용 양식 = 45
• 8. 교차 면역 전기 영동에 의한 C3 분해 산물 동정 = 49
• 참고문헌 = 53
• Abstract = 61