미세변화신증후군에서 말초혈액단핵구가 신사구체 상피세포의 GBM HSPG의 유전자 발현에 미치는 영향 및 이의 측정을 위한 정량적 RT-PCR 법의 개발 = Effect of PBMC Isolated from Children with MCNS to Gene Expression of GBM HSPG in Rats GECs: Including Development of Quantitative RT-PCR to Quantify GBM HSPG mRNA Expression

국문 초록 (Abstract)

미세변화신증후군의 발병원인은 현재까지 확실히 밝혀져 있지 않으나, 이 질환이 부신피질호르몬제제나 면역억제제에 잘 반응하고, 세포면역의 장애가 있는 Hodgkin 임파종에서 발병되며, 홍역이나 말라리아 감염후에 자연 관해가 오며, 알레르기와 연관되어 발병하는 점등으로 볼 때 세포면역의 장애에 의하여 발병된다고 생각된다. 최근, 미세변화신증후군 환자로부터 분리된 T-lymphocyte hybridoma에서 유리된 물질을 흰쥐에게 투여한 결과 단백뇨와 신사구체 상피세포 족돌기의 융합이 일어 났다는 보고가 있으나, 아직까지 이 물질이 무엇인지 규명되지 않고 있다. 동물실험에서 미세변화신증후군 환자로부터 분리된 혈청에 의하여 단백뇨가 초래됨이 관찰되어서 혈청중에 단백뇨를 일으키는 물질을 소위 'cascular permeability factor, VPF'라고 부르고 있으나 아직까지 이의 정확한 실체가 밝혀지지 않고 있다. 또한 치료에 잘 반응하지 않았던 미세변화신증후군 환자의 신장을 이식하였을 때 수일내에 단백뇨의 호전을 보이고 지속적으로 관해를 보이는 것으로 미루어 볼 때 미세변화신증후군은 정상 신장이 비정상적인 환경에 의하여 발병한다는 주장도 있다. 본 연구에서 미세변화신증후군의 표적세포인 사구체 상피세포의 GBM HPPG mRNA 발현이 미세변화신증후군 환아로부터 분리된 말초혈액 단핵구의 cytokine에 의하여 하루만에 억제되었다가 3일후에는 다시 회복되는 것을 관찰하였다. 이들 실험대상 환아는 면역억제제 등을 최소 3개월 이상 사용한 병력이 없었고, 또한 IgA 신증 환아의 말초혈액단핵구에 분비된 cytokine이 직접 사구체 상피세포에 영향을 미치 사구체 기저막 투과성 결정 물질인 GBM HSPG 유전자에 변화를 일으킨다고 할 수 있겠다. 또한 미세변화신증후군 환아의 말초혈약단핵구에서 분비되는 cytokine 중에는 소위 VPF가 포함되어 있다고 할 수 있을 것이며, 추후 VPF의 규명에 관한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 생각한다. 뿐만 아니라 미세변화신증후군 환아의 말초혈액단핵구에 의한 GBM HSPG mRNA 발현의 억제는 가역적으로서 3일후에는 거의 정상수준으로 회복되는 것으로 볼 때 이는 미세변화신증후군의 임상결과와도 일치한다는 결과라고 생각한다.
미세변화신증후군에서 단백뇨의 발생은 사구체 기저막의 투과성의 변화에 의하여 초래된다. 사구체 기저막의 투과성에 관한 연구는 현재까지 많이 이루어졌다. Caulfield 와 Farquhar는 다양한 크기의 dextran을 이용한 사구체 기저막의 투과성에 관한 연구에서 투과성은 dextran의 크기에 반비례함을 증명하였고, Brenner등은 여러 가지 전기적 부하를 가한 dextran을 이용한 실험에서 사구체 투과성은 양전기, 중성 전기, 음전기의 순서로 높았음을 증명하였다. 이로서 사구체 기저막의 투과성은 크기와 전기적 부하에 의하여 결정됨을 알 수 있다. 양이온 표지자 (cationic probe)가 사구체 기저막의 내충과 외충에 부착됨으로 보아 사구체 기저막의 음이온 부위 (anionic sites)가 lamina rara externa 및 interna 에 분포되어 있음을 알 수 있고, 이후 사구체 기저막의 음이온 부위는 heparan sulfate proteoglycan (HSPG) 으로 구성되어 있음이 확인되었다. Kanwar 등은 HSPG를 분해하는 효소인 heparitinase를 신장에 관류시킨후 양이온, 음이온 ferritin 및 소의 혈청 알부민을 다시 신장에 관류시킨 실험에서 heparitinase를 처리한 신장에서는 각종 표지자들이 사구체 기저막을 통과하였으며, 양이온 ferritin은 전기적 성질에 의하여 사구체 기저막의 음이온 부위에 부착되어야 함에도 불구하고 사구체 기저막을 통과하여 음이온 ferritin과 거의 동일한 분포를 보였다. 또한 소의 혈청 알부민은 heparitinase 처치후 사구체 기저막을 완전히 통과하여 요도계에서 발견되었다. 이 연구는 사구체 기저막의 HSPG가 사구체 기저막의 투과성 결정에 가장 중요한 역할을 함을 입증하였다.
사구체 기저막의 HSPG는 산사구체 상피세포에 의하여 만들어 지며, sulfate 와 carboxyl 기를 가지는데 이에 의해 음전기를 띄는 거대 물질로서 사구체 기저막의 전하 장벽 (charge barrier) 뿐만 아니라 크기 장벽 (size barrier) 에도 중요한 역할을 한다. 이는 HSPG의 소실이 있고 단백뇨를 보이는 여러 신질환에서 전하 (charge) 뿐만 아니라 크기 선택성 (size selectivity) 이 동시에 소실됨을 볼때 알 수 있다.
따라서 미세변화신증후군은 면역 이상에 의하여 정상 신장에서 발병하며, 이때 표적이 되는 신장 세포는 사구체 상피세포하고 할 수 있다. 그러나 면역세포에 의하여 직접적으로 사구체 상피세포가 손상을 받는지, 또한 면역의 이상에 의하여 사구체 기저막을 결정하는 물질인 GBM HSPG 의 유전자 발현에 변화가 일어나는지 등은 아직까지 증명되지 않았다. 본 연구결과에서 미세변화신증후군에서 환아의 말초혈액단핵구에 의하여 사구체 상피세포의 GBM HSPG mRNA 발현이 억제되는 것으로 볼 때 미세변화신증후군의 발병은 환아의 면역세포에서 분비되는 VPF에 의하여 사구체 상피세포의 GBM HSPG mRNA 발현이 억제되고 GBM HSPG의 생성이 감소되어서 사구체 기저막의 음전하에 영향을 주고 사구체 기저막의 투과성이 변하여 단백뇨가 초래된다고 생각해 볼 수 있겠다. 그러나 본 연구에서는 사구체 상피세포에서의 GBM HSPG mRNA 발현이 감소된 것은 규명하였으나 GBM HSPG의 생성이 감소한 것은 규명치 않았으므로 추후 미세변화신증후군 환아의 말초혈액단핸구에 의하여 사구체 상피세포에 합성하는 GBM HSPG가 실지로 감소하는지는 좀 더 규명되어야겠다.
현재까지 유전자의 발현정도를 관찰하는 방법으로는 in situ hydridization, northern blot analysis, nuclease protection assay 및 PCT 기법 등이 있으며, 전자의 3 가지 방법은 검체내에 관찰하고자하는 유전자의 발현이 아주 강하거나 혹은 다량의 조직을 필요로 하는 단점이 있으며, 일반적인 PCR 기법은 검사 자체가 상당히 예민하고 소량의 세포로 부터도 유전자 발현을 관찰할 수 있는 장점은 있으나 정량분석이 정확치 않다는 문제가 있다. 따라서 이러한 단점을 보완하고 소량의 조직으로부터 유전자 발현을 측정하는 새로운 분자 생물학적 기법의 발달은 관찰하고자 하는 검체가 아주 소량인 경우 필수적인 요건으로 경쟁적 중합효소 연쇄반응 (competative PCR)은 이러한 문제점을 해결할 수 있는 새로운 기법으로 대두되었다. 경쟁적인 중합효소 연쇄반응은 일반적인 PCR과는 달리 한 실험관 내에 이미 알고 있는 농도의 mutant template를 넣어 검체내의 DNA와 같이 동시에 증폭시킴으로서 상호경쟁적으로 DNA를 중량시키는 것으로 검체내의 DNA의 정량분석은 mutant template와 검체의 DNA가 동시에 equipmolar amplication 된다는 특성을 통하여 분석이 가능하다. 따라서 이러한 competative PCR을 시행하기 위하여서는 mutant template는 크게 3 종류로 genomic DNA, cDNA mutant, cRNA mutant 등이 있다. 현재 가장 많이 쓰이는 방법은 cDNA mutant 를 사용하는 것인데 이는 검사하고자 하는 특정 DNA와 같은 핵산의 배열을 보이나 크기를 보다 길거나 짧게 만들어 DNA 증폭이 끊난 후 겔 전기영동상 band의 크기로 구별을 한다. 그러나 이 방법은 돌연변이를 일으켜야 한다는 기술상의 문제점이 있고, 각 유전자에 대한 primer 설정시에 여러번 재시도(trial and error)를 요구하는 단점이 있으나 현재로서는 가장 유용한 방법으로 사용되고 있다. 본 연구에서는 사구체 상피세포의 GBM HSPG mRNA 발현을 정량하기 위하여 RPD-I의 cDNA mutant를 제작하여서 일명 'mRPDI-285'라 명명하였다. RPDI-285는 497 base pairs의 원 template인 GBM HSPG domain-I에서 중간부분의 약 200 base pairs를 삭제하여 크기가 285 base pairs이다. 또한 RPDI-285를 primer가 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25 amol/ul 의 6가지로 설정되었다. RPDI-285가 본연구자들에 의하여 제작되므로서 향후 사구체 상피세포에서의 GBM HSPG mRNA 발현에 관한 연구에 많은 기여를 하리라 기대한다.

목차 (Table of Contents)

• 서론
• 연구 재료 및 방법
• 절차
• 고찰
• 참고문헌