고효율 배양법을 이용한 혐기성 세균 배양과 Sva1033 분기군에 속하는 갯벌 분리 세균의 유전체 분석

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 미생물 서식 무산소 생태계의 대표적 환경으로서 갯벌과 인체 장내 환경을 선정하여 신규 미생물 분리 및 배양과 군집조사연구를 수행하였다. 한국 서해 강화도 갯벌의 혐기성 미생물을 배양하기 위해 희석-소멸법 기반 고효율 배양(HTC, High-throughput cultivation)을 2회 수행한 결과 총 3,456개의 주입공 중 33.1%의 주입공에서 미생물의 성장이 관찰되었다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 계통발생학적 분석을 통해 총 585개의 순수배양체가 확인되었으며 이들은 Bacteroidota문, Proteobacteria문, Desulfobacterota문, Verrucomicrobiota문과 같은 다양한 계통학적 그룹에 분포하였다. 특히 Desulfuromonadales목의 Sva1033 그룹, Bacteroidales목의 BD2-2 그룹, Kiritimatiellaes목의 R76-B128 그룹, Ignavibacteriales목의 IheB3-7 그룹과 같은 이전에 배양되지 않은 다양한 해양 혐기성 세균 그룹이 본 연구를 통해 새롭게 배양되었다. 그 중 Sva1033 그룹의 IMCC39146과 IMCC39524에 대하여 Illumina MiSeq플랫폼을 통해 완성된 유전체 염기서열을 얻었고, 이에 대해 대사경로 분석을 수행한 결과 이들은 갯벌에서 피루브산 발효 및 철과 질산염 환원을 통해 에너지를 생성할 잠재성을 지닌 것으로 확인되었다. 또한 16S rRNA 유전자 앰플리콘 분석에서 Sva1033은 총 미생물 군집의 4-9%를 차지하여 과 수준에서 두번째로 우점하는 세균그룹으로 확인되었다. 한편, 인체 장내 세균의 최적 배양 및 프로토콜 표준화를 위하여 정상인과 궤양성 대장염 환자의 분변 시료를 이용하여 다양한 조건에서 고효율배양을 3회 수행하였다. 장내 마이크로바이옴의 배양을 목표로 최적화 배지인 Microbiome HTC medium (MHM)를 설계하였다. MHM 최소배지에 장내 세균 생장 최적화를 위한 탄소원, 효모추출물, 쇠고기추출물, 트립톤, 뮤신을 다양한 농도로 첨가한 7가지 조건의 배지조성을 사용하였다. HTC 수행 후 16S rRNA 기반 계통 분석을 통해 385개의 순수배양체가 확인되었다. 이들은 대부분 Bacteroidota문, Firmicutes문, Proteobacteria문에 분포하였으며 Oscillospiraceae 과의 UCG-002 그룹과 같이 이전에 배양된 적이 없는 비배양 세균 그룹 또한 새롭게 확인되었다. 이러한 결과는 고효율배양기법을 장내 환경 등 무산소 환경에 적용하는 것이 보다 다양한 난배양성 혐기성 원핵생물을 성공적으로 분리할 수 있는 방법일 수 있다는 가능성을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In this study, isolation and cultivation of novel bacteria, microbial community structure analyses were conducted by selecting tidal flats and human gut microbiome as the representative environments of microbial anaerobic ecosystems. To cultivate anaerobic bacteria in the tidal flat of Ganghwa Island in the Yellow Sea, high-throughput cultivation (HTC) based on dilution-to-extinction method was applied twice using sediment samples collected in August 2020 and January 2021. Bacterial growth was observed in 33.1% of 3,456 inoculation wells. A total of 585 pure cultures were identified by phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences. Bacterial isolates were distributed in diverse phylogenetic groups such as the phyla Bacteroidota, Proteobacteria, Desulfobacterota and Verrucomicrobiota. Particularly, numerous previously-uncultured anaerobic marine groups such as the Sva1033 clade of the order Desulfuromonadales, the BD2-2 clade of the order Bacteroidales, the R76-B128 clade of the order Kiritimatiellaes, and the IheB3-7 clade of the order Ignavibacteriales were successfully cultivated in this study. Complete whole-genome sequences of the representative isolates, strains IMCC39146 and IMCC39524, belonging to the Sva1033 clade, were obtained by using the Illumina MiSeq platform, and metabolic pathway analysis using their genomes was performed. As a result, both strains were confirmed to have the potential to generate energy through pyruvate fermentation as well as iron and nitrate reduction in tidal flats. Moreover, members of the Sva1033 clade comprised approximately 4-9% of the microbial community, representing the second dominant bacterial group at the family level based on 16S rRNA gene amplicon analysis. For the standardization of the optimal cultivation protocol and the isolation of uncultured bacteria using human intestinal microbiome samples, HTC was performed three times under various conditions using fecal samples from normal individuals and ulcerative colitis patients. Microbiome HTC medium (MHM), an optimized medium targeting the human intestinal microbiome, was designed in this study and used to cultivate the human intestinal microorganisms. The medium composition under 7 different conditions was designed to optimize the growth of the human gut microbiome by adding various concentrations of carbon source, yeast extract, beef extract, tryptone and mucin to the MHM basal medium. A total of 385 pure cultures were identified through phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences. The bacterial isolates were distributed in the phyla Bacteroidota, Firmicutes, and Proteobacteria, and especially in previously uncultured anaerobic bacterial groups such as the UCG-002 group of the family Oscillospiraceae. The results suggest that application of the HTC technique to the human intestinal microbiome may be a successful method to isolate more diverse anaerobic microbiome bacteria.

목차 (Table of Contents)

• 국문 초록 1
• Abstract 2
• 목차 4
• Figure 목록 6
• Table 목록 9
• I. 서론 11
• 1. 강화도 갯벌의 생태환경 및 갯벌 우점 난배양 혐기성 세균 그룹 Sva1033 11
• 2. 인체 마이크로바이옴의 연구 동향과 고효율 배양의 적용 13
• II. 재료 및 방법 14
• 1. 혐기성 배양 환경 설정 및 유지 14
• 2. 갯벌 서식 혐기성 세균의 희석-소멸법 기반 고효율 배양과 군집구조 분석 15
• 2-1. 연구 지역 및 시료 채집 15
• 2-2. 혐기성 환경에서의 희석-소멸법 기반 고효율 배양 18
• 2-3. 갯벌 서식 원핵생물의 군집구조 분석: 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱 23
• 3. 인간 장내 혐기성 미생물의 희석-소멸법 기반의 고효율 배양 25
• 3-1. 임상 시료 분변의 확보 25
• 3-2. 장내 미생물 최적 배양을 위한 장 환경 모사 배지 설계 26
• 3-3. 고효율 배양 기반의 인간 장내 미생물 최적 배양법 탐색과 적용 30
• 4. 배양된 혐기성 세균의 계통학적 분석 34
• 4-1. DNA 추출 및 16S rRNA 유전자 증폭 34
• 4-2. 16S rRNA 유전자를 기반으로 한 계통학적 분석 35
• 5. 갯벌 우점 Sva1033 세균 그룹의 배양과 유전체 분석 36
• 5-1. Sva1033 그룹에 속하는 혐기성 세균의 배양과 계통분석 36
• 5-2. Sva1033 분리 균주의 유전체 시퀀싱 및 분석 37
• III. 실험결과 38
• 1. 갯벌 서식 혐기성 세균의 희석-소멸법 기반 고효율 배양과 군집구조 분석 38
• 1-1. 강화도 갯벌 서식 혐기성 미생물의 배양과 계통 분석 38
• 1-2. 강화도 갯벌 원핵생물 군집의 16S rRNA 유전자 앰플리콘 분석 52
• 2. 인간 장내 미생물의 희석-소멸법 기반 혐기성 고효율 배양과 계통 분석 54
• 3. 난배양성 혐기 세균 그룹 Sva1033의 배양과 특성 분석 60
• 3-1. Sva1033 그룹의 배양과 계통학적 분석 60
• 3-2. Sva1033 그룹 세균의 유전체 분석 63
• IV. 토의 및 결론 70
• V. 참고문헌 77