췌장암세포에서의 전이인자 PAUF와 TLR의 상관성 연구

국문 초록 (Abstract)

PAUF (pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor)는 췌장암 세포에서 과발현되는 분비단백질로, 종양 형성과 전이를 촉진하는 역할을 한다. 이전 연구에서는 PAUF가 단핵구의 TLR2 (toll-like receptor2) 혹은 TLR4 (toll-like receptor4)와 결합하여 면역 회피를 유도하며, 골수 유래 억제 세포(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)와 수지상세포(dendritic cells)의 TLR4와 결합하여 면역 억제를 유도하거나 면역원성을 강화시킨다는 것을 밝혔다. 이러한 면역 세포 뿐만 아니라, 최근에는 난소암 발달과 약제 내성에 있어서 PAUF와 TLR4의 연관성이 보고된 바 있다. 따라서 본 연구에서는 PAUF가 췌장암 세포에서 또한 TLR2 혹은 TLR4와 상호작용하여 기능을 나타낼 것으로 가설을 세우고 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 먼저 정상 췌장 상피세포와 췌장암 세포주에서 TLRs의 발현 수준을 확인하였다. 대부분의 췌장암 세포주에서는 정상 췌장 상피세포에 대비하여 TLRs의 발현이 높게 나타났다. 또한 PAUF는 췌장암 세포주에 농도 의존적으로 결합하였으며, 이러한 결합은 TLR2와 TLR4의 중화항체(neutralizing antibody)를 사용함으로써 감소되었다. 게다가 췌장암 세포에 PAUF를 처리하였을 때 TLR2와 TLR4의 MyD88 의존적인 신호전달경로 인자들이 활성화 되었고, 최종적으로는 신호전달경로의 전사인자 NF-kB가 세포질로부터 핵 안으로 이동됨을 확인하였다. 또한 TLR2와 TLR4의 발현이 낮은 Panc-1 세포주와 TLR2와 TLR4의 발현이 높은 BxPC-3 세포를 이용하여 세포 이동능을 확인하였을 때, TLR2와 TLR4의 중화항체 사용 시 Panc-1의 이동능은 다소 미미하게 감소하였으나, BxPC-3의 이동능은 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 췌장암 세포에 발현되는 TLR2와 TLR4가 전이인자 PAUF의 잠재적 수용체임을 제시하고 있다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 4
• 1. 세포주 및 세포 배양 4
• 2. 재조합 단백질 합성 및 정제 4
• 3. mRNA 추출 및 cDNA 합성 5
• 4. 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 6
• 5. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 8
• 6. 유세포 분석법(Flow cytometric analysis) 10
• 7. 면역형광법(Immunofluorescence, IF) 11
• 8. 웨스턴 블롯팅(Western Blotting) 11
• 9. 면역침강법(Immunoprecipitation, IP) 13
• 10. 이중 발광효소분석법(Dual luciferase assay) 13
• 11. 세포 이동능 측정(Migration) 15
• 12. 통계분석(Statistical analysis) 16
• Ⅲ. 결과 17
• 1. 췌장 세포주에서의 TLRs (toll-like receptors) 발현 수준 17
• 2. 췌장암 세포에 대한 전이인자 PAUF의 결합 19
• 3. 췌장암 세포에서 TLR2, TLR4와 PAUF의 물리적 상호작용 21
• 4. PAUF에 의한 TLR2, TLR4 하위 신호전달경로의 인자 활성화 23
• 5. PAUF에 의한 전사인자 NF-kB의 세포질로부터 핵으로의 이동 25
• 6. PAUF와 TLR2, TLR4의 상호작용에 의한 세포 이동 28
• Ⅳ. 논의 30
• 참고문헌 33
• Abstract 36