Saccharomyces diastaticus glucoamylase의 분비신호서열 분석과 효모에서 defensin의 분비 = Analysis of glucoamylase signal peptide of Saccharomyces diastaticus and secretion of defensin in yeast

국문 초록 (Abstract)

Saccharomyces diastaticus의 glucoamylase 유전자인 STA의 signal peptide (GSP)를 이용한 효모에서 이종단백질의 분비효율을 높이고자 GSP의 변이형을 제조하고 Bacillus의 CMCase에 대한 분비효율을 조사하였다. Bacillus CMCase 구조 유전자를 GAL7 terminator, GAP promoter, 그리고 STA 유전자의 변이형 GSP (ml : Pro-18→Leu-18, m2 : Tyr-13→Leu-13, m3 : Ser-9→Leu-9, m4 : Asn-5→Pro-5)에 재조합하여 효모에서 CMCase를 분비시킬 수 있는 secretion vector를 제작하였다. 변이형 m1, m2, 그리고 m3 은 야생형보다 아미노 말단과 소수성 구역 (h-region)에 더 높은 소수성을 가지도록 하였다. 변이형 m4은 극성 아미노산을 제거하고 단백질의 2차 구조를 파괴하는 proline으로 대체하였다. 배양시간에 따른 CMCase 활성측정과 Western blot 분석 결과 변이형 m4를 제외한 모든 변이형의 경우 Leu으로 대체된 변이형 GSP에 의한 CMCase의 분비가 본래의 야생형 GSP에 의한 분비보다 높았으며 특히 m2와 m3에서 약 2배 높았다. 따라서, GSP의 소수성 구역에 소수성을 가진 아미노산을 첨가하였을 때 분비효율이 증가함을 알 수 있었다. 야생형과 변이형 GSP를 포함하고 있는 재조합 플라스미드를 가지고 있는 모든 효모 형질전환세포에서 당쇄로 인하여 이종의 분자량이 증가된 큰 단백질들이 (90-100 kDa) 분비되었고 효모 세포내에서 발현된 CMCase는 약 60, 52, 그리고 46 kDa의 분자량을 보였다.
STA 유전자를 구성하는 threonine-serine rich region (TS region)이 효모 세포에서 단백질의 분비효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 TS region을 부분적으로 제거한 STA 유전자를 재조합 플라스미드로 제작하였다. STA promoter, signal peptide, 부분적으로 제거된 TS region에 STA의 구조 유전자를 Bacillus CMCase로 교체하여 재조합하고 효모에서 CMCase의 분비효율을 조사하였다. 그 결과 일반적으로 yeast에서 짧은 TS region을 가진 플라스미드가 긴 TS region을 가진 플라스미드보다 높은 CMCase 분비능을 보였다. 따라서, STA 유전자의 TS region은 단백질의 세포외로의 분비와는 관계가 없다고 추정하였다.
Glucoamylase signal peptide와 효모 S. cerevisiae의 분비계를 이용하여 쉬파리에서 유래된 defensin을 항균활성이 있는 활성형의 재조합 defensin 생산계를 구축하고 재조합 효모로부터 생산된 defensin의 특성을 조사하였다. STA promoter, signal peptide 그리고 MF α1의 prosequence에 defensin 유전자를 재조합하여 발현벡터 pSMF1을 제조하여 S. cerevisiae에서 효율적으로 defensin을 발현 분비시킬 수 있었다. 효모에서 분비된 defensin의 분자량을 확인하고 액체배양시의 항균활성력을 조사하기 위해 defensin의 정제를 시도하였다. 분비된 defensin은 Streptococcus aureus와 Listeria mononocytogenes에 활성을 보였다. 대체적으로 열에 안정하며 pH 2.0과 12.0사이에서 안정하였고 proteases에 의해 불활성화 되었다. Defensin을 부분 정제한 시료와 M. luteus를 혼합하여 배양하였을 때 항균활성은 모두 단백질 농도에 비례하여 증가하였다. 정제한 defensin을 6%∼20% gradient Tricine/Tris/SDS-PAGE에서 항균활성을 조사한 결과 약 4.5 kDa에 해당되는 진한 밴드가 항균활성을 보임으로 defensin이 성공적으로 효모에서 발현 분비됨을 확인할 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Glucoamylase of Saccharomyces diastaticus is produced as a large precursor composed of signal peptide (21 amino acid residues), Thr and Ser-rich region (TS region) and functional glucoamylase. To evaluate the utility of the glucoamylase signal peptide (GSP) for the secretion of foreign proteins, four types of GSP mutants (ml : Pro-18→Leu-18, m2 : Tyr-13→Leu-13, m3 : Ser-9→Leu-9, m4 : Asn-5→Pro-5) were constructed and secretion efficiency of each mutant was compared with that of native GSP by the expression and secretion of Bacillus subtilis CMCase under the control of GAP promoter and GAL7 terminator in S. cerevisiae. Mutants 1, 2 and 3 had a higher hydrophobicity than wild type GSP in N-terminal domain and hydrophobic domain. In mutant 4, a polar amino acid was replaced by a helix breaking Pro residue. CMCase activity assay and Western blot analysis revealed that CMCase secretion by GSP mutants replaced by Leu were increased compared with native GSP. In the case of m2 and m3, the substitution of Leu for Tyr-13 and Ser-9 in the hydrophobic region resulted in a twofold increase in the extracellular CMCase activity. The secreted CMCase was heterogenously hyperglycosylated, resulting in the increase in molecular weight (90-100kDa).
For the investigation of the role of TS region in the secretion of heterologous protein, a hybrid plasmid was constructed by ligating YEp24, CMCase structural gene of B. subtilis, and DNA fragment containing STA1 promoter, signal sequence and the entire TS region. The TS region was partially deleted by Ba131 treatment and followed by religation. The deleted nucleotide sequences were analyzed and the secretion level was examined by activity assay and Western blot analysis. Yeast transformants 9 clones with different CMCase activity were selected. About 65-80% of total CMCase activity was detected in the supernatants except for pYESC 24C. Generally, yeast cells transformed with plasmid containing short TS region had higher secretion of CMCase than those containing long TS region. Yeast transformants harboring pYESC 11 without TS region had the highest secretion of CMCase.
To evaluate the utility of the glucoamylase signal peptide for the secretion of foreign proteins, biologically active defensin of insect was tried in yeast, S. cerevisiae c13ABYS86. The defensin of flesh fly could be secreted in yeast by the combination of STA1 promoter, signal peptide of STA1, and pro MFα1. The secreted defensin in yeast was also active against St. aureus and L. monocytogenes and was resistant to heating for up to 30 min, pH range from 2.0 to 12.0, amylases and cellulase but sensitive to proteases. The defensin was purified to homogeniety. Tricine/Tris/SDS PAGE revealed that the molecular weight of purified defensin was estimated to be 4,500 Da.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• Figure and Table Index = iv
• ABBREVIATIONS = vii
• 국문요약 = ix
• 제1장 서론 = 1
• 제2장 연구배경 및 문헌고찰 = 4
• 1. 효모에서의 분비경로와 외래 단백질의 분비 = 4
• 2. 숙주로서의 Saccharomyces cerevisiae와 발현벡터 = 8
• 3. 효모의 단백질 분비신호서열 = 12
• 4. 효모에서 단백질 분비효율을 높이기 위한 연구 = 15
• 5. 효모의 Glucoamylase와 유전자 = 18
• 제3장 실험 재료 및 방법 = 27
• 1. 실험 재료 = 27
• 1. 사용균주 및 플라스미드 = 27
• 2. 배지 및 배양조건 = 27
• 3. 효소 및 시약 = 29
• 2. 실험 방법 = 30
• 1. DNA 분리 = 30
• 2. 형질전환 = 30
• 3. Plate assay에 의한 형질전환체의 선별 = 31
• 4. 효소 활성 측정 = 31
• 5. 항균활성 측정 = 32
• 6. 효모 세포의 fractionation = 32
• 7. Glycosylated CMCase의 deglycosylation = 33
• 8. Western blot 분석 = 33
• (1) Polyclonal antibody의 제조 = 33
• (2) Antibody의 정제 = 33
• (3) Western blot analysis = 34
• 9. 발현된 항균펩티드의 특성과 분리정제 = 34
• 10. Tricine/SDS-PAGE 분석 = 35
• 제4장 연구 결과 및 고찰 = 36
• 제1절 Glucoamylase 분비신호서열의 분석 = 36
• 1. Bacillus CMCase의 항체 제작 = 36
• 2. CMCase 유전자를 분비하는 변이형 GSP를 갖는 재조합 플라스미드의 제조 = 38
• (1) 변이형 GSP 유전자의 합성과 GSP 유전자를 갖는 재조합 플라스미드 제조 = 38
• (2) CMCase 구조유전자를 갖는 재조합 플라스미드의 제조 = 40
• (3) 재조합 플라스미드의 제한호소 절단 및 전기영동분석 = 43
• 3. 변이형 GSP를 갖는 효모형질전환체에서 CMCase의 분비효율 = 43
• 4. 효모형질전환체의 분비된 CMCase의 특성 = 46
• 제2절 STA1 유전자에 존재하는 TS region의 단백질 분비에 대한 영향 = 53
• 1. CMCase 유전자를 분비하는 재조합 플라스미드의 제조 = 53
• 2. 부분 제거된 TS 부위의 분석 = 53
• 제3절 효모에서 항균펩티드 defensin의 발현 및 분비 = 61
• 1. 곤충유래 항균펩티드의 발현 = 61
• (1) 항균펩티드 유전자를 분비하는 플라스미드의 제작 = 61
• (2) 항균펩티드를 생산하는 형질전환체의 선별 = 65
• (3) 효모 숙주에 따른 defensin의 분비 비교 = 67
• (4) 발현된 항균펩티드의 세포부위별 분포 = 67
• 2. 효모에서 분비된 defensin의 특성 = 70
• (1) 열안정성 = 70
• (2) Defensin의 항균범위조사 = 70
• (3) 여러 가수분해효소에 대한 안정성 = 70
• (4) pH 안정성 = 74
• (5) 항균활성의 정량적 분석 = 74
• 3. 효모 형질전환체에서 생산된 defensin의 정제 = 74
• (1) 황산암모늄 침전 = 74
• (2) SP-Sepharose column chromatography = 77
• (3) HPLC를 이용한 defensin의 정제 = 77
• (4) Liquid growth inhibition assay = 77
• (5) 정제한 defensin의 전기영동분석 = 82
• 제5장 결론 = 85
• 참고문헌 = 88
• ABSTRACT = 103