Secretion of Membrane Vesicles from Staphylococcus aureus and Their Cytotoxicity to Host Cells : 황색포도알균이 분비한 막소포체에 의한 숙주세포사

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Gram-negative bacteria produce outer membrane vesicles that play a role in the delivery of virulence factors to host cells. OMVs are released by the budding of the Gram-negative bacterial envelope. Secreted OMVs can disseminate far from the cell and impart biological functions on the environment and on other cells, including playing a role in pathogenesis, quorum signaling, nutrient acquisition, biofilm formation and horizontal gene transfer. OMVs are spherical and bilayered nanovesicles with an average diameter of 20-300 nm. They are composed of LPS, phospholipids, outer membrane proteins, periplasmic proteins, cytosolic proteins, PAMPs, and even nucleic acids. OMVs allow enzymes to reach distant targets in a concentrated, protected, and targeted form. An important mechanism of OMV delivery to consider is endocytosis into eukaryotic cells which bypasses the need for heterotypic fusion of a bacterial outer membrane bilayer into a eukaryotic plasma membrane and results in the entry of the entire OMV into the interior of the cell. Several virulence factors which are packaged in OMVs have been well characterised in Gram-negative bacteria. However, little is known about the membrane-derived vesicles produced by Gram-positive bacteria. The present study examined the production of MVs from S. aureus and investigated the delivery of MVs to host cells and subsequent cytotoxicity. Four S. aureus strains tested, two type strains and two clinical isolates, produced spherical nanovesicles during in vitro culture. MVs were also produced during in vivo infection of a clinical S. aureus isolate in a mouse pneumonia model. Proteomic analysis showed that 143 different proteins were identified in the S. aureus-derived MVs The cytoplasmic proteins were the most abundant (67.1%), followed by membrane proteins (19.6%). Pathogenesis-associated proteins, including IgG-binding protein, ferritin, putative ferrichrome-binding lipoprotein precursor, ABC transporter extracellular binding protein, and lipoprotein for high-affinity iron ion transport, and proteins associated with antibiotic resistance, including β-lactamase, penicillin-binding protein 2, and membrane protein oxaA, were found in the S. aureus MVs, which suggest that bacterial effectors packaged in the MVs are directly associated with bacterial pathogenesis.
The delivery of bacterial components to host cells via the MVs and delivery mechanism of MVs into host cells were determined and showed that MVs were interacted with the plasma membrane of host cells via a cholesterol-rich membrane microdomain and then delivered their component protein A to host cells within 30 min. These suggest that MVs are a vehicle for the delivery of bacterial components to host cells. Intact S. aureus MVs induced apoptosis of HEp-2 cells in a dose-dependent manner, whereas lysed MVs neither delivered their component into the cytosol of host cells nor induced cytotoxicity. In conclusion, this study is the first report that S. aureus MVs are an important vehicle for delivery of bacterial effector molecules to host cells.

국문 초록 (Abstract)

그람 음성균의 외막소포체(outer membrane vesicle)는 숙주 감염시 각종 병원성인자를 숙주세포에 전달하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 그람 양성균에서의 막소포체(membrane vesicle) 분비와 이에 의한 숙주세포 상해에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 본 연구는 다양한 인체 감염증을 일으키는 중요한 병원체인 황색포도알균을 대상으로 막소포체의 분비. 분비된 막소포체의 숙주세포 전달 및 막소포체에 의한 숙주세포 상해 등을 조사하였다. 2주의 황색포도알균 표준균주(ATCC 25923과 ATCC 700699)와 2주의 임상분리균주 (toxic shock syndrome toxin-1 생산 Staphylococcus aureus 103과 methicillin-resistant S. aureus 06ST1048)는 액체배양에서 모두 막소포체를 생산하였다. 황색포도알균의 생체감염에서의 막소포체 분비를 확인하기 위하여 임상분리균주인 S. aureus 06ST1048 균주를 마우스의 기도에 주입한 후 폐렴을 유발하여 폐 조직을 관찰한 결과 황색포도알균의 표면과 균 주위에서 조직에서 균이 분비한 100 nm 정도되는 nanovesicle을 투과전자현미경으로 관찰 할 수 있었다. 황색포도알균이 분비하는 막소포체의 단백을 규명하기 위하여 S. aureus 06ST1048균주가 분비한 막소포체의 단백체를 분석한 결과 총 143 종류의 단백을 동정할 수 있었으며, immunoglobulin G와 결합 할 수 있는 protein A, ß-lactamase 등의 병원성 관련 단백도 함께 동정되었다. 황색포도알균의 막소포체는 숙주세포의 cholesterol 이 풍부한 membrane microdomain인 lipid raft를 통하여 숙주세포 내로 이동하는 것을 protein A 항체를 이용하여 공촛점 현미경으로 확인하였다. 또한 완전한 구조를 가진 막소포체는 숙주세포의 세포질로 이동이 잘 되는 반면, 용해된 막소포체는 숙주세포 내로 이동이 거의 되지 않았다. 막소포체를 HEp-2 세포에 처리한 결과 숙주세포사가 나타났으며, 처리한 막소포체의 농도가 증가함에 따라 숙주세포사도 함께 증가하였다. 그러나 용해된 막소포체는 숙주세포 내로의 이동과 세포사가 모두 일어 나지 않았다.
이러한 결과를 종합하면 황색포도알균은 시험관 배양 및 생체감염에서 막소포체를 분비하며, 다양한 병원성 관련 단백이 함유된 막소포체는 숙주세포막의 lipid raft를 통하여 숙주세포 내로 전달되어 숙주세포사를 유도하였다. 따라서 그람양성균이 분비하는 막소포체는 그람음성균이 분비하는 외막소포체처럼 병원성인자 등 다양한 세균분자를 숙주세포로 전달하는 중요한 매개체임을 본 연구를 통하여 규명하였다.

목차 (Table of Contents)

• INTRODUCTION 1
• MATERIALS AND METHODS 7
• RESULTS 22
• DISCUSSION 40
• SUMMARY 45
• REFERENCES 48
• ABSTRACT i