2,2'-Bipyridyl과 유사 리간드를 포함한 Ruthenium (II) 착물의 전기화학발광 특성 및 응용 = Characterization and application of electrochemiluminescent Ruthenium (II) complexes containing 2,2'-Bipyridyl and related ligands

국문 초록 (Abstract)

전기화학발광 (electrochemiluminescence, ECL)은 전기화학 반응으로부터 직접적으로 화학발광을 일으키거나 필요한 반응물을 생성시켜 화학발광을 일으키는 것으로 분석적 응용 분야에서 매우 유용하게 사용되고 있다. 전기화학발광은 전위를 다양하게 변화시키는 것에 의해 반응을 조절할 수 있고, 선택성을 증가시킬 수 있을 뿐 아니라 발광이 전극 가까이에서 일어나고 전극의 물질, 크기, 위치를 선정할 수 있기 때문에 최대의 발광을 얻기 위한 조절이 가능하다.
본 연구에서는 리간드에 따라 달라지는 Ruthenium (II) 착물의 구조와 ECL과의 상관관계를 연구하고, Ruthenium (II) 착물 중 가장 널리 사용되는 Ru(bpy)_(3)^(2+)의 CL 특성을 전기화학적인 방법과 산화제를 사용한 화학발광 방법 두가지로 비교하였다. 이와 같은 연구 결과를 바탕으로 ECL을 효소를 사용한 바이오센서의 검출 방법으로 적용하였다. ECL 측정은 흐름주입분석 (flow injection analysis, FIA) 장치를 이용하였다. 흐름 셀 (flow cell) 내부에는 전극을 장착하여 Ru(bpy)_(3)^(2+) 용액이 이동되어 오면, 전극에 가해진 +1.3 V의 전압에 의해 즉시 Ru(bpy)_(3)^(3+)로 산화되도록 장치를 고안하였고, 광전증배관 (photo multiplier tube)으로 빛을 검출하였다.
화학발광을 일으키는 물질들 중에서 특히 Ru(bpy)_(3)^(2+) 유도체들은 물질 자체의 안정성, 산화.환원 성질, 수명 (life time) 등의 장점에 의해 많은 연구가 이루어져 왔다. 이러한 특징은 금속 착물의 주변 환경에 의존한다. ECL 특성에 리간드가 미치는 영향과 더 감도 좋은 ECL 물질을 개발하기 위해 benzimidazole이나 bipyridine 유도체 등의 리간드를 합성하여 새로운 형태의 Ruthenium (II) 착물을 합성하였다. 합성한 착물들은 순환전압전류법으로 전기화학 및 ECL 특성을 연구하였다. Ruthenium (II) 착물이 나타내는 ECL 세기는 리간드의 특성에 영향을 받는데, 리간드의 전자 주개 성질이 증가할수록 금속-리간드 전하 이동 (metal to ligand charge transfer) 띠 에너지 간격이 감소하여 비발광 전이과정(radiationless process)이 더 효율적으로 일어나기 때문에, 결과적으로 ECL 발광은 감소하게 되었다.
Ru(bpy)_(3)^(2+)ECL의 비교 분석은 흐름 셀 내의 전극에 전위를 걸어주는 방법과, 산화제로 Ce (IV)을 사용하여 Ru(bpy)_(3)^(3+)로 산화시키는 방법으로 실험하였다. Ru(bpy)_(3)^(2+)CL은 시료의 농도, 흐름계의 유속, pH 등에 영향을 받으므로 좋은 CL 감도를 얻기 위해 이런 조건들을 최적화하는 실험을 하였고, 최적화된 조건하에서 검출한계, 검출범위, 상대표준편차 등의 분석 값을 구하여 비교하였다. 결과적으로 산화제를 사용한 방법이 전기화학적인 방법에 비해 더 큰 CL 세기와 선형 범위를 가지지만, 재현성은 전기화학적인 방법이 더 좋은 것을 알 수 있었다.
알코올 탈 수소효소는 NAD^(+)를 촉매로 사용하여 효소 반응을 통해 NAD^(+)를 NADH로 환원 시킨다. 생성되는 NADH의 농도는 기질의 농도에 비례하기 때문에 NADH의 농도를 측정하여 기질을 정량 할 수 있다. 또한 NADH는 Ru(bpy)_(3)^(2+)와 반응하여 ECL반응을 하기 때문에 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL은 알코올 탈 수소효소와 NAD^(+)를 사용하여 ethanol을 검출하는 방법에 적용될 수 있다. 본 연구에서는 유리 탄소전극에 V_(2)O_(5)-Nafion 복합막으로 Ru(bpy)_(3)^(2+)를 고정시키고, 그 위에 효소를 고정시킨 silicate-Nafion 복합막을 이중 층 형태로 입힌 변형된 전극을 사용하여 ECL을 측정하였다. 이 방법을 통해 ethanol을 0.1 mM까지 검출하였고, ECL 시료를 고정함으로써 매우 경제적이고, 효소와의 반응이 계속해서 순환이 가능한 바이오센서를 만들 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Electrogenerated chemiluminescence (ECL) is the light emission from the generation of emitting excited states via the electron transfer reaction of electrogenerated reactant. In recent years, Ru(bpy)_(3)^(2+)-based ECL has gained importance as a sensitive and selective detection method for the analysis of amine-containing bioactive compounds.
Since the ECL characteristics of the transition metal complexes is strongly dependent upon the local environment of metal complexes, we have become interested in synthesizing and characterizing a series of new inorganic complexes containing different local environments other than Ru(bpy)_(3)^(2+) or known derivatives in order to investigate the effect of ligands on the ECL behavior and thus to develop more sensitive ECL materials. We find that there is a good correlation between the observed ECL intensity and the donor ability of ligands and the number of substitution to the complex.
After characterization of ruthenium (II)-complex, two approaches are comparatively evaluated for the use of tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium (II), Ru(bpy)_(3)^(3+), as a chemiluminescent reagent in FIA : (1) Oxidant mode, external generation of the Ru(bpy)_(3)^(3+) species from a solution mixture of the Ce (IV) and Ru(bpy)_(3)^(2+), and (2) ECL mode, in situ generation of the Ru(bpy)_(3)^(3+) species from a solution mixture of analyte and the Ru(bpy)_(3)^(2+) species as it passes through the reaction/observation cell. Tripropylamine (TPA), oxalate, propranolol, and promazine were used as representative analytes for comparison of these two modes with respect to the influence of experimental variables (reagent concentration, flow rate, pH) and resulting analytical performance (detection limit, working range, measurement precision). We find that each approach has its unique set of strengths and weaknesses. The oxidant mode yields more intense emission than ECL mode and the widest liner dynamic ranges, but working curves have poor linearity.
Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL analytical applications are expanded to include a number of biologically important species. NADH can be detected Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD^(+)) is required to catalyze the enzyme reaction of dehydrogenase. NADH produced by the enzyme reaction is related to the substrate concentration, and therefore the measuring NADH concentration. Thus, this method was applied to the determination of ethanol concentration by using an immobilized Ru(bpy)_(3)^(2+) and alcohol dehydrogenase (ADH). Ethanol was measured in the concentration range 0.1 mM to 100 mM using V_(2)O_(5)/Nafion/Ru(bpy)_(3)^(2+) and silicate/Nafion/ADH composite-modified electrode.

목차 (Table of Contents)

• 차례
• List of Figures = iv
• List of = vii
• 국문요약 = viii
• 제1장 서론 = 1
• 제2장 이론 = 3
• 2.1 Ru(bpy)_(2)^(3+)의 화학발광 = 3
• 2.1.1 화학발광 (Chemiluminiscence, CL) = 3
• 2.1.2 Ru(bpy)_(2)^(3+)의 전기화학발광 (Electrochemiluminescence, ECL) = 5
• 2.1.3 화학적 산화에 의한 Ru(bpy)_(2)^(3+)의 화학발광 = 9
• 2.2 흐름주입분석에서의 Ru(bpy)_(2)^(3+) ECL = 11
• 2.2.1 External generation 방식 = 12
• 2.2.2 In-situ/solution 방식과 in-situ/immobilization 방식 = 12
• 2.2.3 흐름 셀의 부피와 흐름속도의 영향 = 14
• 2.3 전극표면에 Ru(bpy)_(2)^(3+)의 고정화 방법 = 15
• 2.4 Ru(bpy)_(2)^(3+) ECL 바이오센서 = 18
• 2.4.1 효소반응을 이용한 Ru(bpy)_(2)^(3+) ECL 바이오센서 = 18
• 2.4.2 Ru(bpy)_(2)^(3+) ECL 면역 분석법과 DNA-표지물 분석법 = 20
• 제3장 2,2′-bipyridyl 과 유사 리간드를 포함한 Ruthenium (II)착물의 전기화학발광 특성 = 22
• 3.1 서론 = 22
• 3.2 실험 방법 = 25
• 3.2.1 시료 = 25
• 3.2.2 측정 기기 및 실험 기구 = 25
• 3.2.3 순환전압전류법 (Cyclic voltammetry) = 26
• 3.2.4 ECL 측정 = 28
• 3.3 결과 및 고찰 = 29
• 3.3.1 2-(2-pyridyl)-benzimidazole 리간드를 포함하는 Ru (II) 착물의 전기화학 및 ECL 특성 = 29
• 3.3.2 2-(2-pyridyl)-N-methyl-bezimidazole 리간드를 포함하는 Ru (II) 착물의 전기화학 및 ECL 특성 = 32
• 3.3.3 4,4′-dimethylpyridine 리간드를 포함하는 Ru (II) 착물의 전기화학 및 ECL 특성 = 34
• 3.3.4 1.10-phenanthroline 리간드를 포함하는 Ru (II) 착물의 전기화학 및 ECL 특성 = 35
• 3.3.5 4-carboxymethyl-4′-methyl-2,2′-bipyridine 리간드를 포함하는 Ru (II) 착물의 전기화학 및 ECL 특성 = 39
• 3.4 결론 = 42
• 제4장 Tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium (II)의 전기화학발광 (ECL)과 산화제를 이용한 화학발광법 (CL)의 비교 및 특성연구 = 43
• 4.1 서론 = 43
• 4.2 실험 방법 = 45
• 4.2.1 시료 = 45
• 4.2.2 측정기기 및 실험 기구 = 46
• 4.2.3 CL 측정을 위한 최적 조건 결정 = 48
• 4.2.4 CL 세기의 재현성 및 선택성과 검정 곡선 측정 = 49
• 4.3 결과 및 고찰 = 50
• 4.3.1 Ce (IV)과 Ru(bpy)_(3)^(3+)의 최적 농도와 혼합 비율 결정 = 50
• 4.3.2 흐름 속도의 영향 = 53
• 4.3.3 산화제를 사용한 CL 방법에서 Ru(bpy)_(3)^(3+)의 안정성 고찰 = 55
• 4.3.4 pH 효과 연구 = 57
• 4.3.5 CL 세기의 재현성 고찰 = 60
• 4.3.6 분석물질의 선택성 실험 = 61
• 4.3.7 검정곡선 측정 = 63
• 4.4 결론 = 69
• 제5장 알코올 탈 수소효소와 tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium (II)를 이용한 NADH 검출 바이오센서 = 70
• 5.1 서론 = 70
• 5.2 실험 방법 = 75
• 5.2.1 시료 = 75
• 5.2.2 측정 기기 및 실험 기구 = 75
• 5.2.3 V_(2)O_(5)/Nafion 복합막 제조와 Ru(bpy)_(3)^(2+) 고정 = 76
• 5.2.4 Silicate/Nafion 복합막 제조와 알코올 탈 수소효소의 고정 = 76
• 5.2.5 최적 조건 결정과 ethanol 검출 = 77
• 5.3 결과 및 고찰 = 79
• 5.3.1 NADH의 pH 효과 = 79
• 5.3.2 NADH 검정 곡선 측정 = 79
• 5.3.3 실험 조건 최적화 = 82
• 5.3.4 효소 반응의 선택성 실험 = 83
• 5.3.5 Ethanol의 검정 곡선 측정 = 85
• 5.4 결론 = 87
• 제6장 결론 = 88
• 참고문헌 = 90
• 영문요약 = 94