Molecular and biochemical characterizations of monoacylglycerol lipase gene family in Arabidopsis thaliana = 애기장대에서 monoacylglycerol lipase 유전자 family의 분자적 및 생화학적 특성 규명

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Monoacylglycerol lipase (MAGL) catalyzes the final step of TAG breakdown, which is the hydrolysis of monoacylglycerol (MAG) to free fatty acids and glycerol. In the present study, I focused on the molecular and biochemical characterization of MAGL gene family in Arabidopsis thaliana. Computational modeling suggested that 16 Arabidopsis putative MAGLs (AtMAGLs) have a 3-dimensional structure that is similar to a human MAGL. Heterologous expression and enzyme assays indicated that 11 of the 16 encoded proteins indeed possess MAG lipase activity. Additionally, AtMAGL4 displayed hydrolase activity with lysophosphatidylcholine and lysophospatidylethanolamine (LPE) substrates and AtMAGL1 and -2 utilized LPE as substrates. All recombinant AtMAGLs preferred MAG substrates with unsaturated fatty acids over saturated fatty acids and AtMAGL8 exhibited the highest hydrolase activities with MAG containing 20:1 fatty acids. Except for AtMAGL4, -14, and -16, all AtMAGLs showed similar activity with both sn-1 and sn-2 MAG isomers. Spatial, temporal, and stress-induced expression of the sixteen AtMAGL genes were analyzed by transcriptome analyses. AtMAGL:eYFP fusion proteins provided initial evidence that AtMAGL1, -3, -6, -7, -8, -11, -13, -14, and -16 are targeted to the ER and/or Golgi network, AtMAGL10, -12, and -15 to the cytosol, and AtMAGL2, -4, and -5 to the chloroplasts. Among sixteen members, AtMAGL6 and -8 showed strong lipase activities, but several AtMAGLs including AtMAGL16 displayed very weak activities. To understand the internal factors that influence Arabidopsis MAGL activities, the significance of ‘GxSxS motif’, which is conserved in MAGLs was investigated. Frist, examine the significance of serine reside in GxSxG motif, I observed that the presence of a serine protease inhibitor, PMSF decreased the enzyme activity of AtMAGL6 and -8 by IC50 values of 2.30 and 2.35, respectively. Computational modeling showed that amino acid changes of the GxSxG motif in AtMAGL6 and -8 altered the nucleophilic elbow structure, which is the active site of MAGLs. Mutating the GxSxG motif in the recombinant MBP:AtMAGL6 and MBP:AtMAGL8 proteins to SxSxG, GxAxG and GxSxS motifs completely disappeared the activities of the mutant MAGLs. In contrast, no significant differences were observed between the activities of AtMAGL16 wild type form harboring the SxSxG motif, and mutant AtMAGL16 containing the GxSxG motif. These results revealed that the glycine and serine residues of the GxSxG motif are essential for AtMAGL6 and -8 enzyme activities. The results suggested that AtMAGL6 and -8 play a role as MAG lipase, and AtMAGL16 may not be involved in the hydrolysis of lipid substrates in Arabidopsis. In addition, the expression of AtMAGL8 was observed to be predominantly expressed in germinating seeds using microarray analysis. The expression patterns of AtMAGL8 were further examined in various organs of AtMAGL8 pro:GUS transgenic Arabidopsis plants. GUS expression was also observed in developing and germinating seeds, pollen, and pollen tubes. AtMAGL8:eYFP protein was detected to be associated with the surface of oil bodies in germinating seeds and leaves accumulating oil bodies. No remarkable differences were observed in the rate of seed germination, the number and size of cotyledonary oil bodies between T-DNA-inserted atmagl8 knock-out mutant and wild type, suggesting that an allele or alleles of AtMAGL8 might play a role in MAG breakdown during seed germination. Collectively, these results provide the broad characterization of one of the least well-understood group of Arabidopsis lipid-related enzymes and will be useful for better understanding their roles in planta.

국문 초록 (Abstract)

모노아실글리세롤 라이페이즈 (Monoacylglycerol lipase; MAGL)는 TAG 분해과정 중에서 마지막 단계의 모노아실글리세롤 (Monoacylglycerol; MAG)을 글리세롤과 지방산으로 분해한다. 본 연구에서는, 애기장대 TAG 분해의 마지막 단계에 관여하는 MAGL 유전자 family의 분자적 및 생화학적 접근을 통해 그들의 특성을 규명하여 애기장대 MAGL을 밝히는데 중점을 두었다. 여러 lipase 유전자들 중에서 TAG 분해로 생성된 MAG를 분해하는 lipase 유전자 family는 16개로 추정되고 있다. 컴퓨터 모델링을 통해, 이미 잘 알려진 인간 MAGL 단백질 구조와 16개 애기장대 MAGL 단백질은 유사한 3차 구조를 보였으며, 그 중에서 AtMAGL8이 가장 유사하였다. 애기장대 MAGL의 효소활성을 조사하기 위해, 대장균을 이용하여 재조합 단백질을 정제한 후 효소 활성분석을 하였고, 그 중 11개 MAGL 단백질들은 MAGL 활성을 가졌다. 추가적으로, AtMAGL4은 라이조포스파티딜콜린 (Lysophosphatidylcholine; LPC)와 라이조포스파티딜에탄올아민 (Lysophosphatidylethanolamine; LPE)기질에 효소 활성을 보였으며, AtMAGL1과 -2은 LPE 기질에 활성을 보였다. 11개 재조합 AtMAGL 단백질들은 포화 지방산보다 불포화 지방산을 가진 MAG에 대한 효소활성이 높았다. AtMAGL4, -14, 및 -16을 제외한 다른 AtMAGL들은 sn-1과 sn-2 MAG에 대해 비슷한 효소 활성을 보였다. 애기장대의 조직 부위별, 종자발아 시간별, 잎 노화와 스트레스 유도에 따른 AtMAGL 유전자들의 발현을 전사체 데이타를 통해 비교분석하였다. 애기장대 MAGL은 식물 세포 내 어느 위치에서 기능하는지 알아보기 위해, 형광 단백질에 융합시킨 AtMAGL 단백질들을 이용하여 세포 내 소기관 위치를 확인하였다. AtMAGL1, -3, -6, -7, -8, -11, -13, -14 및 -16은 소포체와 골지체에 위치하였고, AtMAGL10, -12 및 -15은 세포질에 위치하며, AtMAGL2, -4 및 -5은 엽록체에 존재함을 확인하였다. 애기장대 MAGL 유전자 family 중에, AtMAGL6와 -8은 가장 강한 효소 활성을 보였지만, AtMAGL16을 포함한 몇몇의 AtMAGL들은 매우 약한 활성을 보였다. 더불어, 애기장대 MAGL 활성에 영향을 미치는 내부적인 요인들을 이해하기 위해서, AtMAGL family에 보존된 ‘GxSxG motif’의 중요성을 조사하였다. 먼저, GxSxG motif이자 catalytic site에 포함된 serine이 애기장대 lipase 활성에 중요한 영향을 미치는지 알아보기 위해, serine protease inhibitor인 PMSF를 이용하여 측정한 결과, AtMAGL6와 -8의 효소활성은 각각 IC50 2.30와 2.35로 감소하였다. 단백질 3차 구조분석을 통해, AtMAGL6와 -8의 GxSxG motif에서 각각의 아미노산 변화는 MAGL 활성부위인 nucleophilic elbow 구조를 변화시켰다. 이러한 결과에 근거하여 GxSxG motif를 SxSxG, GxAxG 및 GxSxS motif들로 각각 돌연변이시켜 maltose binding protein와 각각 퓨전된 AtMAGL6와 -8의 효소활성은 완벽히 사라졌다. 대조적으로, SxSxG motif인 AtMAGL16과 돌연변이시킨 GxSxG motif인 AtMAGL16는 효소활성에 차이가 없었다. 이러한 결과들은 GxSxG motif의 글라이신과 세린이 AtMAGL6와 -8의 효소활성을 갖기 위해 필수적이며 AtMAGL6와 AtMAGL8이 애기장대 MAGL로서 역할을 한다는 것을 보여주며, AtMAGL16은 MAG가 아닌 다른 지질분해에 관여할 수 있음을 의미한다. 추가적으로, AtMAGL8의 발현은 microarray 분석을 통해 발아종자에서 강한 발현을 관찰하였다. 특히, 식물의 발달과 조직 부위별 AtMAGL8의 발현양상을 관찰하기 위하여 AtMAGL8 pro:GUS 애기장대 형질전환체를 제조하였고, 이 형질전환 식물체의 다양한 기관에서 GUS 활성을 조사한 결과, GUS 발현은 발달종자와 발아종자 및 화분에서 관찰되었다. 또한 AtMAGL8:eYFP 단백질이 애기장대 발아종자의 잎과 지방체를 축적한 담배 잎에서 지방체 표면에 존재함을 확인하였다. 그러나 atmagl8 돌연변이체와 야생형 사이에서 종자 발아율과 자엽에서 지방체의 수나 크기에 현저한 차이가 없음을 확인하였고, 이는 AtMAGL8의 하나 또는 여러 개의 alleles가 종자 발아하는 동안에 MAG 분해하는 역할을 함께 할 수 있음을 시사한다. 종합적으로, 본 논문에서 애기장대의 지질 분해관련 유전자들 중에서 MAGL 유전자 family를 포괄적으로 효소특성을 규명하였으며, 앞으로 식물에서 MAGL 역할을 보다 더 잘 이해하는데 도움이 될 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS i
• LIST OF TABLES AND FIGURES v
• ABBREVIATIONS ix
• ABSTRACT (in English) 1
• CHAPTER1 General Introduction 4
• 1.1 Roles and types of plant lipids 5
• 1.2 Roles and types of plant lipases 15
• 1.3 The purpose and contents of this study 23
• CHAPTER 2 Molecular and biochemical characterizations of monoacylglycerol lipase genes family of Arabidopsis thaliana 25
• 2.1 ABSTRACT 26
• 2.2 INTRODUCTION 27
• 2.3 MATERIALS AND METHODS 30
• 2.3.1 Plant materials and growth conditions 30
• 2.3.2 Prediction of three dimensional protein structures 30
• 2.3.3 Complementary cDNA cloning 31
• 2.3.4 Purification of the recombinant MBP fusion MAGL proteins from E.coli 31
• 2.3.5 In vitro enzymatic assays 32
• 2.3.6 Subcellular localization 32
• 2.4 RESULTS 39
• 2.4.1 Identification and phylogenetic tree of 16 Arabidopsis MAGLs 39
• 2.4.2 Computational modeling of Arabidopsis MAGL protein structures 45
• 2.4.3 Optimal pH for acyl hydrolase activities of the recombinant AtMAGL proteins 49
• 2.4.4 Arabidopsis MAGLs exhibit acyl hydrolase activities with MAG and lysophospholipid substrates 51
• 2.4.5 Regiospecificity and substrate specificity of recombinant AtMAGLs 58
• 2.4.6 Expression of Arabidopsis MAGL genes in various Arabidopsis organs, developing pollens, germinating seeds, and senescenced leaves and in young seedlings after abiotic stress treatments 61
• 2.4.7 Subcellular localization of AtMAGLs 66
• 2.5 DISCUSSION 73
• CHAPTER 3 The GxSxG motif of Arabidopsis monoacylglycerol lipase (MAGL6 and MAGL8) is essential for their enzyme activities 82
• 3.1 ABSTRACT 83
• 3.2 INTRODUCTION 84
• 3.3 MATERIALS AND METHODS 87
• 3.3.1 Site-directed mutagenesis of Arabidopsis MAGLs 87
• 3.3.2 Purification of recombinant proteins from E. coli 89
• 3.3.3 Measurement of MAGL activity 89
• 3.3.4 Inhibitor assays 90
• 3.3.5 Prediction of 3-dimensional protein modeling 90
• 3.4 RESULTS AND DISCUSSION 91
• 3.4.1 Phylogenetic relationships of MAGLs between Arabidopsis and other species 91
• 3.4.2 Computational modeling of Arabidopsis MAGLs and their mutated proteins 94
• 3.4.3 Inhibition of AtMAGL6 and -8 enzyme activities in the presence of PMSF, which is a serine protease inhibitor 97
• 3.4.4 The effect of amino acid substitutions on Arabidopsis MAG lipase activity 100
• CHAPTER 4 Molecular characterizations of Arabidopsis monoacylglycerol lipase8 105
• 4.1 ABSTRACT 106
• 4.2 INTRODUCTION 107
• 4.3 MATERIALS AND METHODS 109
• 4.3.1 Plant materials and growth conditions 109
• 4.3.2 GUS assay and microscope 110
• 4.3.3 Subcellular localization assays and Nile red straining 112
• 4.3.4 Identification of the AtMAGL8 T-DNA inserted mutant 113
• 4.3.5 Seed germination 113
• 4.3.6 Preparation for microscopy and Sudan Black B staining 113
• 4.4 RESULTS AND DISCUSSION 115
• 4.4.1 Spatial and temporal expression of AtMAGL8 in Arabidopsis 115
• 4.4.2 Subcellular localization of the fluorescent AtMAGL8 protein 117
• 4.4.3 Isolation of T-DNA-inserted atmagl8 mutant 120
• 4.4.4 Seed germination of wild type and atmagl8 mutant 122
• 4.4.5 Light micrographs of oil bodies in germinating cotyledonary embryonic cells 124
• CONCLUSIONS 126
• REFERENCES 128
• ABSTRACT (in Korean) 147
• CURRICULUM VITAE 151