Analysis of Intestinal Microbiome in Rheumatoid Arthritis (RA) Patients and Evaluation of RA Inhibitory Effect and Safety of Bifidobacterium bifidum ATT = 류마티스 관절염 환자의 장내 균총 분석과 Bifidobacterium bifidum ATT 균주의 류마티스 관절염 억제 효과 및 안전성 평가

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by synovial inflammation of the joints and extra-articular manifestations. Recent studies have shown that microorganisms affect RA pathogenesis. However, few studies have examined the microbial distribution of early RA patients, particularly female patients. In the present study, the gut microbiota profile and microbial functions in early RA female patients, including preclinical and clinically apparent RA cases, were assessed. Changes in microbiological diversity, composition, and function in each group were analyzed using quantitative insights into microbial ecology (QIIME) and phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states (PICRUSt). The results revealed the dysbiosis due to decreased diversity in the early RA patients compared with healthy subjects. There were significant differences in the microbial distribution of various taxa from phylum to genus levels between healthy subjects and early RA patients. Phylum Bacteroidetes was enriched in early RA patients, while Actinobacteria, including the genus Collinsella, was enriched in healthy subjects. Functional analysis based on clusters of orthologous groups revealed that the genes related to the biosynthesis of menaquinone, known to be derived from gram-positive bacteria, were enriched in healthy subjects, while iron transport-related genes were enriched in early RA patients. Genes related to the biosynthesis of lipopolysaccharide (LPS), the gram-negative bacterial endotoxin, were enriched in clinically apparent RA patients. The obvious differences in microbial diversity, taxa, and associated functions of the gut microbiota between healthy subjects and early RA patients highlight the involvement of the gut microbiome in the early stages of RA.
Rheumatoid factor (RF) is an autoantibody that is detected in approximately 80% of patients with rheumatoid arthritis. RF can be also detected in older individuals but the reason is unclear. There are a few RA patients who have a low level of RF in their blood but the reason for this is also unknown. Even though there are many unclear things about RF, several studies have presented a model for RA that immune complex, RF-human IgG-antigen, plays an important role in RA pathogenesis and development. The immune complex containing RF activates the complement after deposition in the joint, resulting in type III hypersensitivity reaction, which causes inflammation of the joint. Although there are a few studies on the association between RA and microbiome, there are no previous studies that have revealed the relationship between gut microorganisms and RF, which is major autoantibody in RA etiology. Therefore, we investigated intestinal microflora according to RF level, one of the RA clinical indicators in the present work. As a result, though alpha and beta diversity were not different between groups divided by RF titer, specific taxa belonging to Actinobacteria phylum including Bifidobacterium genus showed less abundance relatively in RF negative groups than positive. Moreover, the least relative abundance was shown in patients with high titer of RF, over 60 IU/ml. Actinobacteria phylum and Bifidobacterium genus also showed a negative correlation with RF.
In order to determine whether the reduction of the Bifidobacterium genus is the cause or the effects of the disease, we performed an experiment to analyze the effect of supplementation of heat-inactivated Bifidobacterium bifidum ATT, in RA model mice. The results showed that both the incidence and score of RA were significantly lower in Bifidobacterium fed group than the control. The production of autoantibody-like antibodies was also reduced, suggesting that the treatment with Bifidobacterium is effective for the suppression of RA. Since the supplementation of B. bifidum ATT was effective in preliminary RA in vivo study, it can be used as a food or pharmaceutical material. Prior to industrial use of the B. bifidum ATT as a commercial product, verification of safety is an important prerequisite, so the whole genome sequencing of B. bifidum ATT was conducted to acquire various information such as general genome information and function prediction as well as information related safety. In the genome of B. bifidum ATT, there were no virulence factor and genes involved in producing biogenic amines and phosphatidylserine, which plays an important role in platelet aggregation.
Based on the microbiome analyses of patients with RA, preliminary in vivo study and safety assessment through whole genome sequencing, B. bifidum ATT showed the potential to be an effective source of a food material or drug substance for RA modulation with safety. Given further studies such as robust preclinical test and safety assurance through assays such as hemolytic activity and antibiotic resistance test would be implemented, B. bifidum ATT could be developed as a commercial product such as food ingredient or therapeutic agent in real life.

국문 초록 (Abstract)

류마티스 관절염은 관절액을 생성하는 얇은 막인 관절 활막의 지속적인 염증반응이 특정인 만성 염증성 전신 질환이다. 염증의 파급으로 관절의 연골 손상, 골 미란, 관절의 파괴와 변형으로 통증을 유발하고 기능의 장애를 가져올 뿐만 아니라 폐섬유화증, 피부 궤양 등의 관절 외 증상도 함께 초래한다. 류마티스 관절염의 위험 요인으로는 환경적 요인과 유전적 요인이 있다. 류마티스 관절염의 주요 병인인 Th17 세포가 인체 공생 세균에 의해 유도된다는 연구결과를 비롯하여 최근 환경적 요인 중 미생물을 제시하는 연구들이 축적되고 있다. 차세대 유전체 분석법을 통해 직접 환자의 장내 균총을 분석하는 연구들도 다수 수행되었다. 특히 초기 RA환자의 장내 균총 분석 결과 Prevotella copri라는 특정 세균이 건강한 사람 대비 상대적으로 풍부했으며, 이 Prevotella copri를 dextran sulfate sodium으로 염증을 유발한 쥐에 투여했을 때 염증이 더욱 심화되는 것 또한 밝혀졌다.
본 연구에서는 여성에게 호발하는 질환의 특성을 고려하여, 류마티스 관절염 초기 여성 환자 29명을 대상으로 채변 후 16S rRNA 유전자를 이용해 장내 균총을 분석하였다. 환자들은 자가항체는 검출되지만 관절 증상이 없는 환자(PC) 17명과, 자가항체가 검출되면서 관절 증상이 있는 명백한 류마티스 관절염 환자(ST) 12명의 두 그룹으로 다시 나뉘었다. 장내 균총에 미치는 치료제의 영향을 최소화하기위해 환자들은 모두 어떠한 치료도 받지않은 초기 환자들로만 구성되었다. 환자들의 장내 균총을 건강한 사람들의 그것과 비교한 결과, 다양성과 균총의 분포, 균의 기능에 있어서 모두 차이가 있었다. 다양성은 건강한 사람 대비 환자군에서 감소하였으며, 분포는 Actinobacteria phylum과 Collinsella genus가 건강한 사람 대비 환자군에서 감소한 것이 특징이었다. 뿐만 아니라 PICRUSt를 통한 미생물 기능 분석 결과는, 환자 군 중 명백히 증상이 있는 군 (ST)에서 그람 음성 세균 유래의 당지질(LPS) 생성에 관여하는 유전자의 발현이 증가한 것으로 나타났다. 따라서 본 연구는 초기 류마티스 관절염 환자군의 장내 균총은 건강한 사람과 확연히 다르며 특히 염증을 유발할 수 있는 당지질 관련 유전자가 증가한 것으로 보아, 미생물이 병인과 연관이 있음을 밝힐 수 있었다.
초기 류마티스 관절염 환자뿐만 아니라 진행된 환자를 포함하여 총 94명의 환자의 분변을 채변하여 두번째 연구를 진행하였다. 환자들은 자가항체인 Rheumatoid factor (RF) 정도에 따라 음성 그룹(RF ≤ 20 IU/ml)과 양성 그룹 (RF > 20 IU/m)으로 나뉘었다. 양성그룹은 다시 RF 검출양에 따라 저양성 (low positive, 20 < RF ≤ 60)와 고양성 (high prositive, RF > 60)그룹으로 나뉘었다. RF는 류마티스 관절염 환자의 80%에서 발견되는 자가항체로 질병의 진단 지표이다. 또한 인간 IgG 항체 – 미생물 유래 항원으로 이루어진 면역 복합체의 IgG Fc 부분에 결합하여 보체를 활성시켜 염증 반응으로 이어지는 면역반응을 촉발시키는 것으로도 알려져있다. RF 정도에 따른 장내 균총 분석 결과 균총의 다양성에는 차이가 없었으나 Actinobacteria phylum과 Bifidobacterium genus가 RF 양성군에서 음성군 대비 상대적으로 덜 풍부한 것으로 나타났고 특히 RF 고양성군에서 가장 덜 풍부하였다. 스피어만 상관분석결과 역시 Actinobacteria phylum 및 Bifidobacterium genus의 상대적 풍부도와 RF 정도는 통계적으로 유의미하게 음의 상관관계를 보였다. 따라서 이런 장내 균총 구성의 차이가 질병에 의한 것인지, 아니면 균총의 차이로 인해 질병이 시작되거나 증세가 심화되는지 알아보기 위해, 예비적인 동물실험을 수행하였다. 즉, 상대적으로 덜 풍부한 Bifidobacterium genus를 보충해주며 어떤 현상이 나타나는지에 대한 연구를 수행하였다.
동물 실험은 열로 불활성화 시킨 Bifidobacterium bifidum ATT 균을 type II collagen으로 관절염을 유발시킨 쥐에 투여하여 진행되었다. 그 결과 균을 급여하지 않은 쥐보다 균을 급여한 쥐에서 관절염의 발병이 늦었으며, 관절염 점수 또한 유의미하게 낮은 것을 관찰하였다. 류마티스환자의 자가 항체에 해당하는, type II collagen 특이적인 IgG 항체 생성 또한 균 급여군에서 유의미하게 적게 생성되었다. 따라서 RF 고양성군에서 상대적으로 적게 분포하고 있었던 Bifidobacterium을 보충해주면 질병이 조절되는 것을 알 수 있었고, 이를 바탕으로 B. bifidum ATT가 류마티스 관절염 환자들을 위한 건강기능 식품의 소재 또는 의약품의 소재가 될 수 있는 가능성을 확인하였다. 하지만 인간이 어떠한 물질을 식품이나 약으로 섭취할 때는 효능뿐만 아니라 안전성을 검증하는 것 또한 중요하다. 본 연구에서는 B. bifidum ATT균의 전체 유전자 서열을 해독 후 웹 기반 데이터베이스 프로그램을 이용하여 안전성을 검증하였다. B. bifidum ATT에는 플라스미드가 없었으므로 일차적으로 병원성이 없음을 검증하였다. 대표적인 유해균인 Listeria, S. aureus, E. coli, Enterococcus 균에 있는 병독성 유전자 또한 B. bifidum ATT의 유전자 내에 존재하지않음을 확인하였다. 뿐만 아니라 바이오제닉 아민인 histamine과 tysrosin의 생성에 필수적인 효소의 유전자와 혈액 응고에 관여하는 phosphatidyl serine 생성에 필요한 효소의 유전자도 존재하지 않음을 확인하였다.
결론적으로, 본 연구에서는 류마티스관절염 환자의 장내 균총 분석 결과, 예비적인 동물 실험과 전체 유전자 서열에 기반한 안전성 분석을 통해 B. bifidum ATT가 류마티스 관절염 조절에 유용한 식품 및 의약품 소재가 될 수 있음을 밝혔다. 철저한 전임상 실험과 용혈 활성, 항생제 저항성 등과 같은 실제 실험에 기반한 안전성 검증 등의 추가 연구가 수행된다면 B. bifidum ATT는 식품 원료나 치료제와 같은 상업적인 제품으로 개발될 수 있을 것이다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Literature Review ……………………………………………·1
• 1.1 Rheumatoid arthritis ……………………………………………·2
• 1.1.1 Risk factor of rheumatoid arthritis……………………6
• 1.1.2 Clinical indicator of rheumatoid arthritis……………8
• 1.1.3 Therapeutics of rheumatoid arthritis………………····9
• 1.2 Rheumatoid arthritis and microbiota………………………··11
• 1.2.1 Oral microbiota ……………………………………····11
• 1.2.2 Gut microbiota ………………………………………··15
• 1.3 Objective of the present research ……………………………·16
• Chapter 2. Gut Microbial Composition and Function Are Altered in Patients with Early Rheumatoid Arthritis ·……………………………18
• 2.1 Introduction……………………………………………………··19
• 2.2 Materials and methods………………………………………···22
• 2.2.1 Research subjects……………………………………···22
• 2.2.2 Sample collection and next generation sequencing··25
• 2.2.3 Bioinformatic analysis………………………………···26
• 2.2.4 Statistical analysis……………………………………··27
• 2.3 Results…………………………………………………………····29
• 2.3.1 Differences in gut microbial diversity between rheumatoid arthritis patients and healthy subjects……····29
• 2.3.2 Featured microbial taxa in patients with early rheumatoid arthritis………………………………………····34
• 2.3.3 Microbial function analysis ………………………···42
• 2.4 Discussion………………………………………………………··45
• Chapter 3. Investigation of Intestinal Microflora According to Clinical Indicator of Rheumatoid Arthritis……………………………52
• 3.1 Introduction ……………………………………………………··53
• 3.2 Materials and methods………………………………………····57
• 3.2.1 Research subjects……………………………………···57
• 3.2.2 Sample collection and next generation sequencing ……………………………………………………···…………··59
• 3.2.3 Bioinformatic analysis ………………………………··60
• 3.2.4 Statistical analysis ……………………………………··61
• 3.3 Results …………………………………………………………·63
• 3.3.1 Comparison of bacterial alpha and beta diversities……………………………………………………···63
• 3.3.2 Alteration of microbial composition according to RF level…………………………………………………………·····67
• 3.3.3 Association between fecal microbiota and clinical indicator ……………………………………………………····76
• 3.4 Discussion……………………………………………………···79
• Chapter 4. Efficacy and Safety Evaluation of Bifidobacterium bifidum ATT…………………………………………………………………………83
• 4.1 Introduction·……………………………………………………·84
• 4.2 Materials and Methods………………………………………··87
• 4.2.1 Animals……………………………………………………·87
• 4.2.2 Preparation of Bifidobacterium bifidum ATT·………··87
• 4.2.3 Preparation of type II collagen antigen and immunization·……………………………………………………·88
• 4.2.4 Assessment of arthritis…………………………………···88
• 4.2.5 Immunoglobulin measurement………………………····89
• 4.2.6 Complete genome sequencing, assembly and annotation …………··…………··…………··…………··……·····………······89
• 4.2.7 Safety evaluation through complete genome sequence
• …………··…………··…………··…………··………···………····90
• 4.3 Results………………………………………………………·······91
• 4.3.1 Disease inhibitory effect of Bifidobacterium bifidum ATT………………………………………………………………··91
• 4.3.2 Antibody expression in serum of mice with rheumatoid arthritis…………………………………………………………····94
• 4.3.3 General genomic information of Bifidobacterium bifidum ATT acquired by complete genome sequencing…···96
• 4.3.4 Production of biogenic amine………………………·······99
• 4.3.5 Platelet aggregation……………………………………···103
• 4.3.6 Virulence factor………………………………………·····106
• 4.4 Discussion ……………………………………………………···108
• Chapter 5. Conclusion…………………………………………………·113
• References ………………………………………………………………··118
• 국문 초록………………………………………………………………… 136