Molecular mechanism of inhibition of hepatitis B virus replication by anti-cancer drug, Sorafenib = 간암표적치료제 Sorafenib의 B형 간염 바이러스 복제 저해의 분자생물학적 기전

국문 초록 (Abstract)

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 간 질환으로 이어지는 가장 큰 원인 중 하나로, 만성적인 간염은 간경변을 일으키며 간암으로 진행될 수 있다. 현재 B형 간염을 치료하기 위해, HBV의 복제를 억제시키는 HBV 치료 약제가 처방되어 사용되고 있다. 하지만 현재 알려진 치료 약제들은 각자 한계점을 가지고 있기 때문에, 이를 극복하기 위해서는 다른 기전으로 HBV 복제를 억제시키는 연구가 필요하다. 이에 본 연구에서는 HBV 복제 억제에 대한 다른 관점으로, 체내 분자적 신호전달 경로 및 HBV 유전자 발현을 증가시킨다고 알려져 있는 전사인자를 통해 HBV 복제를 억제할 수 있는 방법에 대해 알아보았고 그 약제로 간암의 표적 항암제인 Sorafenib을 선정했다.
먼저 Sorafenib의 HBV 복제 억제를 밝히기 위해, Sorafenib이 HBV 복제에 관여하는 HBV promoter의 전사활성을 감소시켰고 HBV 유전자 발현을 mRNA 수준과 단백질 수준에서 감소시킴을 확인하였다. 또한 Cell viability assay를 통해 이와 같은 Sorafenib의 효과가 독성에 의한 세포 사멸에 기인하는 것은 아니라는 것을 확인하였다. 이어서 Sorafenib이 JNK pathway를 억제시킴을 확인하였고, 이 JNK pathway는 HBV 유전자 발현을 조절함을 알 수 있었다. 이어서 Sorafenib에 의해 표적되어 HBV 유전자 발현을 조절하는 간세포의 전사인자로 FXR이 작용한다는 사실을 확인하였고, FXR은 그 활성이 JNK pathway와 관련되어 있다는 연구 결과를 바탕으로 FXR을 Sorafenib에 의한 JNK pathway의 표적 유전자로 선정하였다. FXR은 HBV 복제를 높인다는 연구결과는 이미 보고된 바 있고, 본 연구에서는 Sorafenib이 FXR에 의해 증가한 HBV 유전자 발현을 감소시킴을 확인하였다. 또한 FXR의 활성 및 안정성이 JNK pathway에 의해 조절된다는 점을 확인하여 Sorafenib이 JNK pathway-FXR로 이어지는 세포 내 신호 전달 경로를 억제함을 알 수 있었다. 위의 결과들을 종합해서, Sorafenib은 JNK pathway를 억제시킴으로써 FXR에 의해 유도된 HBV 유전자 발현을 억제시킴을 확인하였다.
본 연구를 통해 Sorafenib이 항암 효과뿐만이 아니라, 항바이러스 효과도 가져서 HBV 복제 저해 효과가 있음을 알 수 있으며 이는 HBV 치료 약제에 대한 새로운 접근으로 의미가 있을 것이라 생각된다. 또한, 분자적 기전의 차이가 있기 때문에 알려진 HBV 치료 약제들과 병합하였을 때 더 좋은 효과를 보일 수 있을 것이라 기대한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Hepatitis B virus (HBV) infection is a major cause of chronic liver diseases. Several established drugs for HBV treatment have a few limitations. Here, sorafenib, the anti liver cancer drug, has another mechanism for treatment of HBV. Sorafenib is known for multikinase inhibitor and has anti-viral effect on some viruses in vitro. In this study, the effect of sorafenib on HBV gene expression was demonstrated. Sorafenib decreased HBV promoter activity, HBV RNA levels and protein levels. Furthermore, focusing on the significance of molecular signaling pathways and transcription factors which regulate HBV gene expression, the overall pathway including them was confirmed. As a result, sorafenib inhibited HBV replication via inhibiting c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway. In the process, the farnesoid X receptor (FXR) had an influence on HBV replication as a transcription factor. FXR is one of the nuclear receptors which regulate cholesterol-bile acid homeostasis. Also, FXR increased HBV gene expression, and FXR was under control of JNK pathway. Notably, phosphorylation of JNK had an influenced on FXR protein levels, not mRNA levels. We demonstrated that JNK pathway regulated HBV promoter activity, RNA and protein levels, in addition, FXR increased HBV gene expression. They were suppressed by sorafenib. In conclusion, sorafenib inhibited HBV replication via suppressing JNK pathway which regulates FXR activity.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• II. MATERIALS AND METHODS 9
• 1. Cell culture 9
• 2. Plasmid constructs and reagents 9
• 3. Drug and inhibitor treatment 10
• 4. Luciferase assay 11
• 5. Cell viability assay 11
• 6. RNA isolation, RTPCR and realtime PCR 12
• 7. SDSPAGE and western blotting 14
• III. RESULTS 16
• 1. Sorafenib suppresses HBV replication 16
• 2. Sorafenib suppresses HBV replication via inhibiting JNK pathway 20
• 3. Sorafenib suppresses FXRinduced HBV replication 25
• 4. Sorafenib suppresses FXRinduced HBV replication via inhibiting JNK pathway 31
• IV. DISCUSSION 36
• V. REFERENCES 41
• VI. ABSTRACT (in Korean) 47