ORF 서열 및 UTR에 의한 Cyclin B의 번역 조절 기작 연구

국문 초록 (Abstract)

Cyclin B는 Mitotic/Meiotic Promoting Factor(MPF)의 주요 구성 요소 중 하나로, 난핵포(Germinal Vesicle, GV) 단계의 난자세포에서 번역과 분해에 의해 단백질의 양이 조절된다. 생쥐에서는 3가지 종류의 Cyclin B(B1, B2, B3)가 발현되며 난자의 성숙과 관련된 것은 Cyclin B1과 Cyclin B2이다. 생쥐의 Cyclin B1 단백질은 GV 난자세포에서 낮은 수준으로 발현되며, 세포주기가 재개됨에 따라 발현 수준이 증가한다. 반면 Cyclin B2 단백질은 GV 상태부터 높은 수준으로 발현된다. 또한, Cyclin B1은 다른 생물종에서는 3ʹ UTR에 의해 서로 다르게 조절된다. 본 연구에서는 생쥐 Cyclin B1과 Cyclin B2의 발현 양상 차이를 조사하고, Cyclin B1 단백질의 발현이 생쥐와 제브라피쉬에서 어떤 기작으로 조절되는지 조사하였다. HEK293T 세포에서 생쥐 Cyclin B1의 3ʹ UTR을 포함하는 리포터 유전자는 Cyclin B2 3ʹ UTR를 포함하는 리포터의 발현보다 높았다. 이러한 차이점은 각 유전자의 3ʹ UTR 서열을 교환한 Cyclin B1과 Cyclin B2 단백질의 발현에서는 발견되지 않았다. 생쥐와 제브라피쉬의 Cyclin B1 유전자를 HEK293T 세포에 형질주입 하였을 때, 생쥐 Cyclin B1은 정상적으로 발현되나 제브라피쉬 Cyclin B1은 발현되지 않았다. 제브라피쉬 Cyclin B1의 3ʹ UTR 서열을 생쥐 Cyclin B1의 3ʹ UTR 서열로 치환한 경우 단백질이 발현되었다. 3ʹ UTR, 5ʹ UTR 혹은 ORF 서열을 포함하는 리포터 유전자를 이용하여 HEK293T 세포와 생쥐 난자세포에서 발현 조절 기작을 확인하였다. Cyclin B1 ORF는 HEK293T 세포와 생쥐 MI 난자세포에서 발현을 음성적으로 조절한다. GV 난자세포에서는 5ʹ UTR에 의해 리포터 유전자의 발현이 증가하는 효과가 나타났으며, ORF 서열과 함께 존재할 때 상승효과가 나타났다. HEK293T 세포에서 리포터 유전자는 Cyclin B2의 5ʹ UTR에 의해 양성조절 되고, ORF 서열에 의해서는 음성조절 되는 것을 확인하였다. 결론적으로, Cyclin B 단백질의 번역은 3ʹ UTR 뿐만 아니라 5ʹ UTR과 ORF 서열에 의해서도 조절된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cyclin B is a major component of Mitotic/Meiotic Promoting Factor(MPF) and its amount is regulated by translation and degradation in the Germinal Vesicle (GV; prophase I) stage oocyte. Three types of Cyclin B(B1, B2 and B3) are expressed in mice, and Cyclin B1 and Cyclin B2 are involved in the maturation of oocytes. The mouse Cyclin B1 protein is expressed at a low level in mouse GV oocytes and the protein levels increase after meiotic resumption. On the other hand, Cyclin B2 protein is expressed at a high level from GV state. In addition, also it is known that Cyclin B is regulated differently in different species by its 3ʹ UTR. In this study, I investigated the difference in expression between mouse Cyclin B1 and Cyclin B2 and checked the regulational mechanism of Cyclin B1 expression by the 3ʹ UTR from mouse or zebrafish Cyclin B1. Expression of reporter gene which contains 3ʹ UTR of mouse Cyclin B1 is higher than that of mouse Cyclin B2 in HEK293T cells. These differences were not found in the expression of the Cyclin B1 and Cyclin B2 proteins, which exchanged the 3ʹ UTR sequence of each gene. When mouse or zebrafish Cyclin B1 which contains its Cyclin B1 3ʹ UTR was transfected into HEK293T cell, mouse Cyclin B1 was expressed normally, but zebrafish Cyclin B1 was not detected. Only when the 3ʹ UTR of zebrafish Cyclin B1 was replaced with that of mouse, protein was well expressed. Using several reporter constructs that contain 3ʹ UTR, 5ʹ UTR or ORF of Cyclin B, the translational regulation of reporter genes was checked in HEK293T cell or mouse oocyte. The ORF element of mouse Cyclin B1 negatively regulates the expression of reporter in HEK293T cells and in mouse MI oocytes. In GV oocytes, the 5ʹ UTR of mouse Cyclin B1 increases the expression of reporter and it shows synergistic effect with Cyclin B1 ORF element. The 5ʹ UTR of mouse Cyclin B2 enhances the expression of reporter protein in HEK293T cells. In contrast, Cyclin B2 ORF blocked the expression of the reporter. In conclusion, the translation of Cyclin B is controlled not only by 3ʹ UTR but also 5ʹ UTR and ORF.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• 그림 목차 i
• 국문 초록 ii
• 영문 초록 iv
• I. 서론 1
• II. 목적 8
• III. 연구 재료 및 방법 9
• 1. 세포배양과 형질주입 9
• 2. 유전자 클로닝 9
• 3. HEK293T 세포의 Dual-Luciferase assay 10
• 4. Western blot 11
• 5. In vitro transcription 11
• 6. 생쥐 난자세포 준비 12
• 7. 생쥐 난자세포의 Dual-Luciferase assay 12
• IV. 결과 14
• 1. HEK293T 세포에서 3ʹ UTR에 의한 생쥐 Cyclin B1과 Cyclin B2의 단백질 번역 조절 비교 14
• 2. 생쥐 Cyclin B1과 생쥐 Cyclin B2의 발현 양상 비교 16
• 3. HEK293T 세포에서 종에 따른 3ʹ UTR의 단백질 발현 조절 비교 21
• 4. 생쥐 Cyclin B1과 제브라피쉬 Cyclin B1의 발현 양상 비교 24
• 5. HEK293T 세포에서 생쥐 Cyclin B의 5ʹ UTR과 ORF에 의한 리포터 유전자의 발현 수준 확인 26
• 6. 생쥐 난자세포에서 생쥐 Cyclin B1 리포터 유전자의 발현 수준 확인 29
• V. 고찰 34
• VI. 결론 39
• VII. 참고문헌 40