Optimal dose study of allogeneic islet transplantation for the treatment of insulin-dependent diabetes in Macaca fascicularis monkeys = 인슐린 의존성 당뇨병 원숭이 (Macaca fascicularis)의 동종 췌도 이식을 위한 최적 용량 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Many groups are studying clinical allogeneic islet transplantation in a primate model, but few studies have focused on the optimal islet dose for insulin independence after transplantation in primate models and on the relationship between rejection and islet amyloid polypeptide (IAPP) expression as well as best biopsy site in the recipient’s liver. Evaluated the dose (10,000 - 25,000 islet equivalents (IEQ)/kg) needed to achieve normal glycemia without exogenous insulin after transplantation using eleven cynomolgus monkeys, and analyzed the characteristics exhibited in the islets after transplantation. Five whole livers of diabetic cynomolgus monkeys that underwent insulin-independent survival for an extended period after allo-islet transplantation were analyzed the characteristics and distribution tendency. 10,000 IEQ/kg (n2) failed to control blood glucose level, despite injection with the highest dose of exogenous insulin, and 20,000 IEQ/kg group (n5) achieved unstable control, with a high insulin requirement. However, 25,000 IEQ/kg (n4) achieved normal glycemia without exogenous insulin and maintained it for more than 60 days. Immunohistochemistry results from staining islets found in liver biopsies indicated that as the number of transplanted islets decreased, the amount of IAPP accumulation within the islets increased, which accelerated CD3+ T cell infiltration. In the whole liver, islets were more distributed in S2 depending on tissue size, however, the number of islets per tissue size was high in S1 and S8. Statistical analysis revealed the characteristics of islets in S1 and S8 were relatively like other segments despite various transplanted islet dosage and survival times. In conclusion, the optimal transplantation dose for achieving a normal glycemia without exogenous insulin in our cynomolgus monkey model was >25,000 IEQ/kg, and the accumulation of IAPP early after transplantation, which depends on the transplanted islet dose. Segment 1 of the cynomolgus monkey liver which exhibited high islet density and reflected the overall characteristics of transplanted islets, can be considered a reasonable candidate for a liver biopsy site in this monkey model. These findings can be considered one factor in rejection of allogeneic islet transplantation as well as can be used as a reference for monitoring of transplanted islets after clinical islet transplantation.

국문 초록 (Abstract)

제1형 당뇨병은 인슐린을 생산하는 췌도의 기능 상실과 같은 문제로 인해 정상적인 혈중 당 농도의 항상성이 결여되는 내분비대사질환으로, 췌도 이식이 이상적인 치료법으로 간주된다. 하지만 이식 초반 췌도 들은 급성혈액매개성 염증반응 (instant blood-mediated inflammatory reaction, IBMIR)과 같은 수여자 면역체계에 의해 다량 파괴된다. 이런 문제를 극복하기 위해 췌도 표면 개질, 다양한 면역억제 프로토콜을 활용한 수여자 관리 등이 시도되고 있다. 그러나 임상 환경에서 이러한 연구를 진행하기에는 많은 제약이 존재한다. 이를 극복하기 위해 연구자들은 인간을 대신할 수 있는 대안으로, 인간과 면역체계, 신체 및 장기 구조, 당뇨병의 특성이 유사한 영장류를 이용한다. 하지만 영장류에서 동종 췌도 이식 연구를 위한 이상적인 용량과 이식 후 영장류의 간으로 이식된 췌도를 생검하기 위한 적합한 위치에 대한 연구는 희박하다. 따라서 본 연구는 Macaca fascicularis 원숭이에서 동종 췌도 이식 후 인슐린 비 의존적 정상 혈당을 달성할 수 있는 이상적인 이식 용량 및 이식 후 간 생검을 위한 최적의 위치를 확인하기 위해 진행됐다.
몸무게 1kg 당 20,000 개 (IEQ/kg)의 동종 췌도를 이식 받은 그룹은 과량의 외인성인슐린을 요구하면서 불완전한 혈당 조절을, 25,000 IEQ/kg 이상을 이식 받은 그룹은 이식 직후부터 외인성 인슐린이 필요 없는 정상 혈당을 보였고, 이 결과는 90일 이상 안정적으로 유지됐다. 인슐린과 함께 췌장내 베타세포에서 생산되는 호르몬인 Islet amyloid polypeptide (IAPP)는 일반적으로 인슐린과 함께 분비돼 신체의 항상성을 유지하지만, 과도한 소포체 스트레스 등과 같은 원인으로 생성 후 췌도 내 축적된 IAPP는 췌도의 기능을 잃는데 영향을 미치며, 2형 당뇨병의 원인으로도 잘 알려져 있다. 본 연구 결과는, 췌도를 이식 받은 원숭이 간에서 관찰된 췌도 내 IAPP 축적 정도는 이식 받은 췌도의 용량이 적을수록 증가하는 경향을 나타냈다. 또한, 췌도 내 IAPP 축적은 췌도 주변 또는 내부로 CD3+ T 세포의 침윤과 양의 상관관계가 있음을 시사했다. 이는, 본 연구의 결과가 이식하는 췌도의 용량이 높을수록 이식 성적이 상대적으로 좋은 기존의 결과들을 좀 더 명확히 설명할 수 있는 근거가 될 수 있음을 시사한다.
한편, 다양한 용량의 동종 췌도 이식 후 각기 다른 생존기간을 보이지만, 인슐린 비 의존적 혈당 정상화를 달성한 다섯 마리의 원숭이들로부터 얻은 간 전체를 면역조직화학적으로 분석하였다. 그 결과, 췌도는 간 전체에 고르게 분포할 것이라는 예상과는 달리, 세그먼트 1과 8에 높게 분포되어 있었다 (세그먼트 1은 해부학상, 8보다 생검 하기에 더 적합한 부위이다). 흥미로운 점은, 췌도의 분포에서는 차이는 보이나, 발견된 췌도의 크기나 인슐린 발현 정도와 같은 췌도 특성은 간 전체 세그먼트와 유사했고, 이런 특징은 다섯 마리 원숭이 모두 일치한다는 점이다.
결론적으로, Macaca fascicularis 원숭이에서 이식 후 외인성 인슐린 비 의존적 혈당 정상화를 위한 이상적인 이식 용량은 25,000 IEQ/kg이었고, 낮은 용량을 이식 받은 췌도에 특히 더 축적된 IAPP는 이식 거부반응과 관계가 있음을 시사한다. 또한, 간 전체에 이식된 췌도를 생검하기 위한 가장 적합한 생검 위치는 세그먼트 1임을 제안한다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Optimal allogeneic islet dose for transplantation in insulin‑dependent diabetic Macaca fascicularis monkey 1
• I. Introduction 1
• II. Materials & Methods 4
• 1. Animals and animal care. 4
• 2. Donor-recipient monkey selection. 4
• 3. Induction and management of diabetes mellitus. 5
• 4. Isolation and culture of islets. 6
• 5. Purity, Viability, and functionality assessment of isolated islet. 7
• 6. Allogeneic islet transplantation and perioperative management. 8
• 7. Postoperative management. 9
• 8. Liver biopsy and immunohistochemical staining. 10
• 9. Analysis of immunohistochemically stained images. 11
• 10. CD3+ T cell infiltration rate grade criteria. 12
• 11. Statistical analysis. 13
• III. Results 14
• 1. Transplant-recipient monkeys. 14
• 2. Control of blood glucose levels depended on transplanted islet dose. 16
• 3. Liver biopsy results after transplantation. 20
• 4. Characteristics of grafted islets. 21
• 5. Dose of transplanted islets affected IAPP accumulation within the islets. 24
• IV. Discussion 29
• Chapter 2. Integrated whole liver histologic analysis of the allogeneic islet distribution and characteristics in a nonhuman primate model 34
• I. Introduction 34
• II. Materials & Methods 37
• 1. Animals and animal care. 37
• 2. Induction of diabetes mellitus in cynomolgus monkeys. 37
• 3. Islet isolation. 38
• 4. Immunosuppression and islet transplantation. 38
• 5. Perioperative management. 39
• 6. Preparation of whole liver and pancreas tissue. 39
• 7. Slide preparation and immunohistochemistry staining of isletgrafted whole liver tissue. 40
• 8. Image acquisition. 41
• 9. Image analysis. 41
• 10. Statistical analysis. 41
• III. Results 44
• 1. Graft function after islet transplantation. 44
• 2. Whole liver tissue processing. 46
• 3. Two-dimensional mapping of whole liver. 47
• 4. Area of liver tissue. 50
• 5. Distribution of allogeneic grafted islets in the liver tissue. 50
• 6. Characteristics of allogeneic grafted islets in the liver tissue. 51
• IV. Discussion 54
• REFERENCE 59
• 논문요약 (국문) 71