RANKL이 생쥐 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포의 증식, 생존 및 가슴샘세포 형성촉진인자 생성에 미치는 효과 = Effect of receptor activator of nuclear factor-KB ligand on the production, survival and thymopoietic factor-production of mouse thymic subcapsular/cortex epithelial cells

국문 초록 (Abstract)

가슴샘은 골수에서 유래한 T 전단계세포를 성숙한 T 세포로 분화시키는데 관여하는 중추면역기관이다. 가슴샘 미세환경은 가슴샘세포의 증식과 분화 및 성숙에 관여한다. RANKL (receptor activator of nuclear factor-κB ligand)은 TNF (tumor necrosis factor) superfamily에 속한 type II transmembrane protein으로서, 주로 수지상세포에서 발현되는 RANK (receptor activator of nuclear factor B)와 결합하여 수지상세포의 생존을 촉진시키고, 혈구형성전단계세포로부터 뼈파괴세포로의 분화를 유도할 뿐만 아니라, T 세포의 활성과 T 세포 및 B 세포의 성숙에 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 본 연구에서는, 재조합 수용성 RANKL 단백질을 생산하여, RANKL이 생쥐 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포에 미치는 효과를 분석하였다.
수용성 재조합 RANKL을 제조하기 위해, RANKL의 extracellular domain (Asp76-Asp316)에 대해 역전사중합효소연쇄반응을 수행하여 생쥐의 가슴샘으로부터 RANKL 유전자를 증폭하였다. 증폭된 RANKL 유전자를 pET-32b expression vector에 삽입하여 E.coli strain BL21/DE3에 형질전환시킨 후 단백질을 과발현시키고, Ni-NTA agarose gel을 이용하여 정제하였다.
생쥐 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포에서 RT-PCR 분석을 통해 RANKL 및 RANK 유전자의 발현을 확인하였다. RANKL은 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포 및 가슴샘세포의 증식을 촉진하였을 뿐만 아니라 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포 및 가슴샘세포의 세포사멸을 유도시킨 다음 RANKL을 처리하였을 때 Bcl-2, Bcl-xL mRNA의 발현 증가와 Bax mRNA의 발현 감소를 확인할 수 있었다. 또한 RANKL은 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포에서 가슴샘세포형성촉진인자인 IL-6, IL-7 및 GM-CSF mRNA의 발현을 현저하게 증가시켰다.
따라서 본 연구의 결과는 RANKL이 생쥐 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포의 증식 및 생존에 중요한 역할을 수행할 뿐만 아니라 IL-6, IL-7 및 GM-CSF의 생성을 촉진시킴으로서 가슴샘에서 T 세포의 증식 및 분화과정에 중요한 역할을 수행할 수 있음을 시사해준다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The thymus is the central lymphoid organ for development of bone marrow-derived precursor cells into mature T-cells. The thymic epithelial cells provide the specialized microenvironment for the proliferation, differentiation, and maturation of the immature T-cells, thymocytes. Receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) is a type II membrane protein of the TNF family and plays a critical role in the regulation of osteoclastogenesis. RANKL expressed on osteoblastic stromal cells has been shown to support osteoclast differentiation originated from hematopoietic precursors. Interestingly, RANKL is also expressed on cells of the immune system including T cells and dendritic cells.
This study was performed to investigate the effect of RANKL on the proliferation and survival of mouse thymic subcapsular/cortex epithelial cells. Following the transformation of BL21/DE3 cells with the expression construct, the overexpression of sRANKL protein was induced by the addition of 1 mM IPTG and the overexpressed sRANKL protein was purified using Ni-NTA agarose gel.
The results showed that the mouse subcapsular/cortex epithelial cells expressed RANKL and RANK. The stimulatory effect of sRANKL on the proliferation of mouse thymic subcapsular/cortex epithelial cells and thymocytes was observed. It was also found that sRANKL promoted survival of the thymic subcapsular/cortex epithelial cells and thymocytes, and enhanced the anti-apoptotic gene (Bcl-2 and Bcl-xL) expression but inhibited the pro-apoptotic gene (Bax) expression, when tested in the subcapsular/cortex thymic epithelial cells after H_(2)O_(2) treatment. sRANKL appears to upregulate IL-6, IL-7, and GM-CSF expression in the thymic subcapsular/cortex epithelial cells.
In conclusion, these results indicate that RANKL stimulates the proliferation and survival of the thymic epithelial cells as well as thymocytes, and enhances the thymopoietic factor-production of the thymic subcapsular/cortex epithelial cells.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 서론 = 1
• 실험재료 및 방법 = 6
• 결과 = 20
• 고찰 = 36
• 요약 = 42
• 참고문헌 = 44
• Abstract = 54