vanA, vanB gene 동시 검출을 위한 LAMP primer 연구 = A Study on the LAMP Primer for Simultaneous Detection of vanA and vanB gene

국문 초록 (Abstract)

반코마이신 내성 장알균 (vancomycin-resistance enterococci, VRE)은 가장 많이 사용되는 항생제 중 하나인 반코마이신에 내성을 획득한 균이다.
주로 사용되고 있는 VRE의 진단법 중에서 가장 빠르다고 할 수 있는 PCR (polymerase chain reaction)은 반응 종료까지의 시간만 3시간 이내로, 각 반응 단계마다 온도에 변화가 필수적인 PCR의 특성상 전용 장비가 필요하기에 검체 추출 후 이를 보유한 기관까지 운송부터 진단 결과까지의 시간을 감안하면 반나절은 소모된다.
반면 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)법을 이용해 진단할 경우 PCR과 달리 보통 60-66℃내의 등온에서 annealing과 extension이 진행되므로 값비싼 장비가 불필요하며, FIP/BIP (inner primer)와 F3/B3 (outer primer), LF/LB (loop primer)까지 2-3쌍의 primer를 사용하므로 특이성이 높고, 1시간 이내로 진단 결과를 확인할 수 있기 때문에 신속한 진단에 있어 이점을 가지고 있다.
VRE는 Vancomycin과 Teicoplanin에 내성을 가진 vanA gene이나, Vancomycin에 내성을 가진 vanB gene을 보유하고 있어 반코마이신에 내성을 보이는데, 현재 PCR이나 LAMP법을 이용한 VRE의 진단에선 vanA 혹은 vanB gene에 대한 각각의 primer를 제작하여 사용하고 있다. 하지만 각각의 primer를 진단에 사용할 경우 그 primer에 해당 하는 gene만 검출이 가능하므로, 2 set를 사용하지 않으면 다른 gene을 검출할 수 없다.
이 연구에선 vanA gene과 vanB gene을 모두 검출 가능한 LAMP primer를 제작하여 VRE 진단의 가능성을 확인하고 반응 시간, 반응 온도 등의 조건을 실험을 통해 최적화하고자 한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Vancomycin-resistance enterococci (VRE) is a bacterium that has acquired resistance to vancomycin, one of the most commonly used antibiotics, and has vanA gene resistant to Vancomycin and Teicoplanin or vanB gene resistant to Vancomycin. Therefore, if have vanB gene, can use Teicoplanin instead of Vancomycin, but if have vanA gene, should use other antibiotics that are not resistant.
The PCR (polymerase chain reaction), which can be said to be the fastest among the mainly used diagnostic methods of VRE, takes 3 hours to end the reaction.
Also PCR, which requires a change in temperature at each reaction stage, requires a dedicated machine, so it takes half a day considering the time from transportation to the institution that holds it after sampling.
However, when diagnosed using the Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay, unlike PCR, annealing and extension usually proceed at an isothermal temperature within 60-66℃, so it can be diagnosed with constant temperature equipment.
In addition, since two to three pairs of primers are used up to FIP/BIP (inner primer), F3/B3 (outer primer), and LF/LB (loop primer), it is highly specific, and the reaction is completed within an hour, which has an advantage in rapid diagnosis.
VRE is resistant to vancomycin because it has vanA or vanB gene, and each primer for vanA or vanB gene is produced and used in the diagnosis of VRE using PCR or LAMP method.
But, when each primer is used for diagnosis, only the gene corresponding to the primer can be detected, so other genes cannot be detected unless two sets are used.
In this study, the possibility of VRE diagnosis is confirmed by designing an LAMP primer capable of detecting both vanA and vanB gene, and conditions such as reaction time and reaction temperature are optimized through experiments.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 본론 4
• 제 1 장 : 재료 및 방법 4
• 1. 실험 재료 4
• 1. 1. vanA, vanB gene 동시 검출 LAMP primer 제작 4
• 1. 2. 최적 vanA, vanB 동시 검출 LAMP primer 선별 4
• 1. 3. LAMP assay 5
• 1. 4. vanA, vanB gene cloning 5
• 2. 실험 방법 6
• 2. 1. 최적 vanA, vanB gene 동시 검출 LAMP primer 선별 6
• 2. 2. LAMP assay 6
• 2. 3. vanA, vanB gene Cloning 6
• 제 2 장 : 결과 9
• 1. 결과 9
• 1. 1. 최적 vanA, vanB gene 동시 검출 LAMP primer 1차 선별 9
• (1) 4set primer의 vanA gene 검출 가능 여부 확인 9
• (2) primer set2, 3의 vanA gene 검출 가능 여부 확인 9
• (3) primer set2의 온도 및 LF 종류에 따른 vanA gene 검출 가능 여부 확인 11
• 1. 2. 최적 vanA, vanB gene 동시 검출 LAMP primer 2차 선별 15
• (1) vanA, vanB gene 동시 검출 primer set 재구성 및 위양성 확인 15
• (2) primer set의 vanA, vanB gene 동시 검출 가능성 확인 15
• (3) primer set3, 4의 vanA, vanB gene 동시 검출 가능성 재확인 16
• (4) primer set3, 4의 최적 온도 확립 실험 16
• (5) primer set3의 vanA, vanB gene 최소 검출 농도 확인 실험 17
• (6) primer set3의 vanA, vanB gene 최소 검출 시간 확인 실험 17
• 1. 3. 항온 수조 27
• (1) LAMP assay 27
• (2) cloning 후 추출한 DNA의 LAMP 진행 27
• (3) set4 위양성 문제 30
• Ⅲ. 결론 33
• Ⅳ. 참고문헌 35
• Ⅴ. ABSTRACT 38