Purification and Crystallization of the Recombinant Catalytic Subunit of Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase

국문 초록 (Abstract)

당 대사에 관여하는 Pyruvate dehydrogenase phosphatase (PDP)는 해당과정에서의 대사 산물인 pyruvate를 acetyl CoA로 만들어 구연산 회로로 진입시켜주는 효소인 pyruvate dehydrogenase complex (PDC)의 활성을 조절하는 중요한 효소이다. PDP의 catalytic subunit는 PDC의 dihydrolipoamide acetyltransferase(E2), PDP regulatory subunit (PDPr), 그리고 칼슘 결합 도메인 등으로 구성되어 있는 것으로 추측되어지고 있다. 본 연구에서는 PDP 단백질을 분리정제하고 결정화 하고자 하였다. PDP는 catalytic subunit(PDPc, Mr 52,600 Da)과, regulatory subunit (PDPr 95,600 Da)으로 구성되어 있으며 칼슘 존재하에 PDPc는 dihydrolipoamide acetyltransferase(E2) component와 결합하여 기질인 인산 E1 component의 탈 인산화율을 증가시킨다. PDPc는 intrinsic 칼슘 결합부위를 가지며 두 번째 칼슘 부위는 E2 존재 하에 형성된다. 이러한 특이한 상호반응을 이용한 GSH-Sepharose-GST-L2 matrix를 이용하여 약 1000 U/㎎의 specific activity를 갖는 순수 PDPc를 약 80%의 yeild로 얻어 결정화에 사용하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Pyruvate dehydrogenase phosphatase (PDP) is a mitochondrial protein serine/threonine phosphatase that catalyzes the dephosphorylation and concomitant reactivation of the pyruvate dehydrogenase component of the Pyruvate dehydrogenase component of the Pyruvate dehydrogenase complex (PDC). PDP consists of a catalytic subunit (PDPc, Mr 52,600) and regulatory subunit (PDPr, Mr 95,600). In the presence of Ca²^(+), PDPc binds to the dihydrolipoamide acetyltransferase (E2) component of the pyruvate dehydrogenase complex in proximity to its substrate the phosphorylated E1 component, thereby increasing the rate of dephosphorylation. PDPc possesses an intrinsic Ca²^(+) binding site and a second Ca²^(+) site is generated in the presence of E2. Using unique interaction, highly pure PDPc was produced by the GSH-Sepharose-GST-L2 matrix with a specific activity of approx. 1000 U/㎎ and a yield of about 80%.