Bacterial Degradation of Medium-Chain-Length Polyhydroxyalkanoate

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 자연적인 토양 환경과 MCL-PHA 분해 미생물이 농화 배양된 미네랄 배지 내에서 세균에 의해 이루어지는 MCL-PHA의 생분해 양상을 관찰하고, MCL-PHA 분해 미생물의 분리 및 동정과 MCL-PHA depolymerase의 유전적 접근을 통한 염기 서열 분석으로 MCL-PHA 분해 미생물의 다양성을 조사하였다. 토양 환경에서 MCL-PHA의 생분해율을 알아본 결과 PHN은 2.15%, PHDD (=)는 6.91%의 생분해율을 보였고 다양한 조건이 제한된 실험실 조건에서는 PHN가 18.89%, PHDD (=)가 66%로 토양 환경보다 높은 분해율을 보였으며, SCL-PHA인 PHBV는 94.33%로 MCL-PHA보다 높은 분해율을 보였다. 두 조건에서 생분해가 이루어진 PHA film의 표면 구조와 결정화도 변화를 알아보기 위해 각각 SEM과 XRD를 이용하여 분석하였을 때, 모든 PHA film에서 미생물에 의한 생분해가 진행됨에 따라 표면 거칠기가 증가하고 구멍과 균열의 크기가 커지고 그 빈도가 높아졌다. 또한 PHA의 결정화도를 분석하였을 때 고분자의 결정형과 무정형의 물리적 상태가 PHA 분해율에 영향을 끼치는 중요 요인 중 하나라는 것이 밝혀졌다. MCL-PHA 분해 미생물은 PHO를 유일한 탄소원으로 첨가해준 M9 고체 배지를 이용한 clear zone 실험을 통해 다양한 환경으로부터 분리하였다. 총 32종의 균주를 분리하였고 이 중 Streptomyces spp. 와 Pseudomonas spp. 가 각각 약 56%와 34%로 우점하였으며, Pseudoxanthomonas spp. Rhodococcus sp. 또한 분리하였다. 이러한 MCL-PHA 분해 미생물 분리 결과와는 대조적으로, MCL-PHA 분해 미생물의 농화 배양 과정 동안 미생물 군집을 확인하기 위해 실행한 DGGE 분석에서 MCL-PHA 분해미생물로써 알려지지 않았던 종들이 발견되었고, 이들의 16S rRNA 서열을 기존의 database와 비교하였을 때 대부분의 균주가 유전적으로 가장 가까운 종과 97% 이하의 유사도를 보였으므로 이는 새로운 계통학적 위치에 존재하는 세균이라고 여겨지며, 따라서 이 결과는 자연 환경에서 MCL-PHA의 분해가 기존에 알려진 것 보다 더 넓은 범위의 종에 의해 수행될 것이라는 것을 짐작할 수 있는 근거가 된다. 분리한 MCL-PHA 분해 미생물 중 MCL-PHA 분해 활성이 높았던 Streptomyces sp. FXJ3가 생산하는 MCL-PHA depolymerase의 유전자 (phaZ) 서열을 밝히기 위해 cloning을 실행하였다. Streptomyces sp. FXJ3의 phaZ는 총 876 bp의 ORF로 구성되어있으며 291개의 아미노산으로 구성된 분자량 30.647 kDa의 단백질을 인코딩한다. 아미노산 서열에서 아미노 말단에는 substrate-binding domain, C 말단에는 catalytic domain을 가지며 lipase box (152Gly-153His-154Ser-155Gln-156Gly)와 catalytic triad (154Ser-198Asp-228His), oxyanion hole (176Gln)이 존재한다.
핵심어: 생분해, Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates (MCL-PHAs), MCL-PHA 분해 미생물, Extracellular MCL-PHA depolymerase (PhaZ)

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 11
• 2. 1. Synthesis and analysis of PHA 11
• 2. 2. Preparation of PHA films 12
• 2. 3. Preparation of PHA suspension 12
• 2. 4. Experimental designs and sampling gears in soil 12
• 2. 5. Biodegradation of PHAs in laboratory condition 13
• 2. 5. 1. Enrichment culture of PHA degraders 13
• 2. 5. 2. PHA biodegradation and sampling gaers 16
• 2. 6. Determination of PHA biodegradation 16
• 2. 7. Counting and isolation of PHA degraders 16
• 2. 8. Denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE) 17
• 2. 9. Isolation of MCL-PHA degraders 17
• 2. 10. Identification of PHA degraders 18
• 2. 11. Identification of extracellular MCL-PHA depolymerase gene 18
• 3. Results and Discussions 20
• 3. 1. Determinant of PHA monomer composition 20
• 3. 2. Biodegradation of PHAs in soil 22
• 3. 3. Biodegradation of PHAs in laboratory condition 25
• 3. 3. 1. Enriched bacterial population to PHAs degradation 25
• 3. 3. 2. Biodegradation of PHAs 28
• 3. 4. Determinant of PHA biodegradation 31
• 3. 4. 1. Change of surface in PHA films 31
• 3. 4. 2. Change of crystallinity of PHA films 38
• 3. 5. Diversity of MCL-PHA degrading bacteria 40
• 3. 6. Identification of Streptomyces sp. FXJ3.004 PhaZ 43
• 4. Conclusions 45
• 5. References 47
• 국문초록 55