세피아테린 환원효소 녹아웃 생쥐에서 테트라히드로비오테린 생합성의 분석 = Investigation of tetrahydrobiopterin synthesis in sepiapterin reductase knockout mouse

국문 초록 (Abstract)

테트라히드로비오테린 (tetrahydrobiopterin, BH4)는 방향족아미노산 수산화효소들, 일산화질소 합성효소들, glyceryl-ether monooxygenase의 필수적인 조효소이다. BH4의 적당한 수준은 간에서는 페닐알라닌 대사, 뇌에서는 신경전달물질의 합성과 밀접한 관련이 있다. 세피아테린 환원효소 (sepiapterin reductase, SR)는 BH4 생합성의 마지막 단계를 촉매하는 효소이다. 최근 보고된 SR 결핍 환자는 신경전달물질의 생합성 저하로 고통을 겪고 있으나 고페닐알라닌증은 보이지 않는다. 이 환자들과는 대조적으로 SR 녹아웃 생쥐는 신경전달물질의 저하뿐만 아니라 고페닐알라닌증을 보인다. SR 유전자 치환에 따른 생리적 변화가 사람과 생쥐 각각에서 다르게 나타나는 이유를 알아보기 위하여, SR 녹아웃 생쥐의 간과 뇌에서 BH4 생합성을 비교 연구 하였다. GTP cyclohydrolase Ⅰ (GTPCH)의 효소활성은 녹아웃 생쥐의 간과 뇌에서 유사한 감소를 보였다. 그러나 6-pyruvoyltetrahydropterin synthase (PTPS)의 활성은 정상 생쥐에 비해 간에서 4.6 %감소하였으며, 뇌에서는 15.6% 감소를 보였다. 이러한 결과는 녹아웃 생쥐의 간에서 정상의 3% 수준에 해당하는 낮은 BH4 생합성이 PTPS에 기인하는 것임을 보여준다. 녹아웃 생쥐의 Western blot 분석을 실시한 결과 SR 단백질은 녹아웃 생쥐에서 전혀 발견되지 않았음에도 불구하고 녹아웃 생쥐의 BH4의 수준은 정상의 30% 수준이었다. 이러한 결과는 SR이 결핍되어도 carbonyl reductase에 의해 BH4 생합성이 이루어짐을 증명한다. 일산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS의 활성은 간보다 뇌에서 월등히 높게 나타났다. 녹아웃 생쥐의 뇌에서 NOS 활성은 절반정도 감소하였으나 BH4를 첨가하면 회복됨을 보여주었다. 이는 BH4가 뇌에서 NOS의 조효소로서의 역할이 중요함을 추정케 한다. 마지막으로 이상하게도 헤테로 녹아웃 생쥐에서 BH4의 수준은 정상 생쥐와 유사함에도 불구하고, GTPCH, PTPS, dihydropteridine reductase, NOS의 활성은 절반 정도 수준으로 감소하였다. 이러한 연구결과들은 앞으로 사람에서 SR 결핍으로 인한 생리적 변화들을 이해하는데 중요한 정보들을 제공해줄 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Tetrahydrobiopterin(BH4) is an essential cofactor for aromatic amino acid hydroxylases, nitric oxide synthases, and glyceryl-ether monooxygenase. A proper level of BH4 is closely associated with neurotransmitter synthesis and phenylalanine metabolism in brain and liver, respectively. Sepiapterin reductase(SR) is an enzyme catalyzing the final step of BH4 biosynthesis. Recently SR deficient patients were reported to suffer from insufficient neurotransmitter synthesis but not hyperphenylalaninemia. In contrast to human patients, SR knockout mouse was shown to exhibit hyperphenylalaninemia as well as diminished levels of neurotransmitters. In order to understand the different physiological consequences in the livers between human and mouse, the BH4 biosynthesis in SR knockout mouse were comparatively investigated in the liver and brain. The enzymatic activities of GTP cyclohydrolase Ⅰ (GTPCH) were similarly decreased in the liver and brain of the KO homo(-/-) mouse. However, 6-pyruvoyltetrahydropterin synthase(PTPS) activity was decreased to 4.6% of normal in the liver, while to 15.6% in the brain, implicating PTPS was responsible for the remarkably low level of BH4 in the homo liver(3% of normal). BH4 level was determined to be 30% of normal in the homo brain, in spite of the complete absence of SR protein in the homo mouse as demonstrated by Western blot analysis. The result therefore supported the putative role of carbonyl reductase involvement in BH4 synthesis in the absence of SR. NOS activity was determined to be significantly higher in the brain than liver. NOS activity in the homo brain was also decreased to a half level of normal but recovered much when BH4 was supplemented to the assay, suggesting that BH4 may have an important role as a NOS cofactor in the brain. Finally, it was strange to find that the enzyme activities of GTPCH, PTPS, dihydropteridine reductase, and NOS in the hetero(+/-) mouse were also decreased by a half levels compared to normal, although BH4 levels were similar. The results may provide valuable information for understanding the physiological consequences of SR deficiency in human.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = 0
• List of figures = i
• List of tables = ii
• 국문 초록 = iii
• ABSTRACT = ⅳ
• Ⅰ. 서론 = 1
• 1. Tetrahydrobiopterin의 생합성 및 조절 = 1
• 2. 고등동물에서의 BH4의 기능 = 3
• 2.1. BH4의 조효소 기능 = 3
• 2.2. BH4 관련 질환 = 6
• 3. 연구 목적 = 6
• Ⅱ. 연구재료 및 방법 = 8
• 1. 연구 재료 = 8
• 1.1. 시약 및 효소 = 8
• 1.2. 실험동물 = 8
• 1.3. 기타 시약 및 실험장비 = 8
• 2. 연구 방법 = 9
• 2.1. 생쥐의 유전자형 판별 = 9
• 2.1.1. PCR primer 합성 = 9
• 2.1.2. 생쥐의 genomic DNA 분리 = 9
• 2.1.3. PCR 반응 = 9
• 2.2. 생쥐의 조직에서 테리딘 분석 = 10
• 2.2.1. 생쥐의 간과 뇌 조직 추출 = 10
• 2.2.2. 테리딘 시료의 준비 = 10
• 2.2.3. HPLC 분석 = 10
• 2.3. 생합성 관련 효소 활성 분석 = 10
• 2.3.1. 시료의 준비 = 10
• 2.3.2. GTPCH 활성측정 = 11
• 2.3.3. PTPS 활성측정 = 11
• 2.3.4. SR 활성 측정 = 12
• 2.3.5. DHPR 활성측정 = 12
• 2.4. GTP 정량 = 12
• 2.5. 조직 내 일산화질소 측정 = 13
• 2.6. NOS 활성측정 = 13
• 2.7. Western hybridization = 14
• Ⅲ. 결과 = 15
• 1. 테리딘 화합물 분석 = 15
• 2. SR 돌연변이 생쥐의 테리딘 생합성 효소 활성 분석 = 15
• 2.1. GTPCH 활성 측정 = 15
• 2.2. PTPS 활성 측정 = 16
• 2.3. SR 활성 측정 = 16
• 2.4. DHPR 활성 측정 = 16
• 3. GTP정량 = 17
• 4. 일산화질소의 정량과 NOS 활성 측정 = 17
• 4.1. 일산화질소의 정량 = 17
• 4.2. NOS 활성 측정 = 17
• 5. Western blot hybridization = 18
• Ⅳ. 고찰 = 28
• Ⅳ. 참고문헌 = 30
• 감사의 글 = 33