이묘산(二妙散)이 인간 진피 섬유아세포에서 TNF-α로 유도된 MMP-1 발현에 미치는 영향 = (The) effects of Er-miao-san on TNF-α-induced MMP-1 expression in human dermal fibroblasts

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblasts; HDFs)를 이용하여 동량의 황백(Phellodendri Cortex; PC, Phellodendron amurense Ruprecht)과 창출(Atractylodis Rhizoma; AR, Atractylodes lancea D.C)로 구성된 이묘산(二妙散, Er-Miao-San; EMS)의 TNF-α로 유도된 MMP-1 발현에 미치는 영향을 검증하고자 하였다. 이묘산이 HDFs의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 DPPH radical scavenging, 세포 생존율, 세포 증식률, 세포 배가시간, 세포 유주능을 측정하였다. 이묘산이 TNF-α로 유도된 MMP-1 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blotting, qRT-PCR, NF-κB transactivation activity assay를 실시하였다. 이묘산 70% ethanol 추출물에서 가장 우수한 항산화력을 보였고, 이묘산과 창출은 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였다. 이묘산은 농도 의존적으로 세포 배가 시간이 가장 짧게 나타났으며, 세포 유주능 관찰에서도 무처리군보다 세포가 빠르게 이동함을 확인할 수 있었다. TNF-α로 유도된 MMP-1의 발현은 이묘산 전처리 시 가장 효과적으로 감소하였으며, 이묘산 농도 의존적으로 감소하였다. 이묘산은 TNF-α에 의해 감소된 inhibitor of κB (IκB) 단백질 양을 회복시켜 NF-κB를 효과적으로 억제하였으며, HDFs에서 nuclear p65의 단백질 농도를 3배 이상 감소시켜 NF-κB의 핵 내로의 이동, IL-1ß와 IL-8의 발현 억제, NF-κB 전사활성을 저해함으로써 염증반응을 감소시켰다. 이묘산은 NF-κB inhibitor와의 비교에서 NF-κB inhibitor와 유사한 수준의 MMP-1 감소 효과를 나타냈다. 이러한 실험 결과들로 이묘산은 NF-κB pathway를 통하여 TNF-α로 유도된 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하였음을 확인하였다. 이묘산의 세포 내 항염증 효과는 황백이 군(君, Monarch, Jun)약, 창출이 신(臣, Ministor, Chen)약이 되는 한방 처방의 상호작용에 의한 것으로 황백과 창출이 함께 배합되어 염증 억제 효과가 증가된 것으로 사료된다. 이는 이묘산이 향후 피부 염증 관리 및 예방 천연물 화장품 소재로서 가능성이 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The goal of this study was to investigate the effects of Er-Miao-San (EMS) on the expression of TNF-α-induced MMP-1 in human dermal fibroblasts (HDFs). EMS is comprised of equal amounts of Phellodendri Cortex (PC, Phellodendron amurense Ruprecht) and Atractylodis Rhizoma (AR, Atractylodes lancea D.C). The techniques used to investigate the effects of EMS included western blotting, qRT-PCR, and NF-κB transactivation activity assay. Also studied were the effects of EMS on DPPH radical scavenging, cell viability, cytotoxicity, doubling time, cell migration, and proliferation of HDFs. DPPH radical scavenging activity varied according to the conditions of EMS extraction, with the highest activity seen when EMS was extracted in 70% EtOH. Treatment with either EMS or AR increased cell viability of HDFs, in a concentration-dependent manner, but treatment with PC decreased cell viability at concentrations of 500 μg/mL or higher. The shortest time for cell-doubling, indicating active cell proliferation, occurred when cells were treated with 500 μg/mL of EMS. Cell migration was faster in cells treated with the EMS extraction than in control cells. The results of these experiments demonstrated that TNF-α-induced MMP-1 expression was decreased in HDFs pre-treated with, and this decrease was more than double that in control cells treated with TNF-α alone. In cells pre-treated with 500 μg/mL EMS, the decrease was more than three times that in the control cells treated with only TNF-α. These results indicate that EMS inhibits TNF-α-induced expression of MMP-1 in a concentration-dependent manner. Treatment with EMS restored the amount of IκB protein reduced by TNF-α, thus effectively inhibiting NF-κB. It also reduced the concentration of nuclear p65 protein by more than one-third in HDFs, thus inhibiting the translocation of NF-κB into the nucleus and NF-κB transactivation and accordingly reducing the inflammatory response. The results of these experiments suggest that EMS effectively inhibited TNF-α-induced MMP-1 expression through the NF-κB pathway. The anti-inflammatory effects of EMS stem from the interactions of the Oriental medicine prescription that turns PC into Monarch (Jun) medicine and AR into Ministor (Chen) medicine. Mixing of PC and AR seems to enhance the anti-inflammatory effects of EMS. EMS has the potential to be a novel material to prevent and manage skin inflammation.

목차 (Table of Contents)

• List of tables ⅳ
• List of figures ⅴ
• ABSTRACT ⅷ
• Ⅰ. 서 론 1
• 1. 연구의 필요성 및 목적 1
• 2. 이론적 배경 5
• 1) 이묘산 5
• 2) 한방 배합 17
• 3) 인간 진피 섬유아세포 19
• 4) 염증 21
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 34
• 1. 이묘산, 황백, 창출 추출물 제조 34
• 2. 인간 진피 섬유아세포 배양 36
• 3. DPPH radical scavenging activity 36
• 4. 세포 생존율 측정 37
• 5. 세포 증식도 측정 37
• 6. mRNA extraction 37
• 7. cDNA 합성 38
• 8. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 38
• 9. Western blotting 39
• 10. Nuclear fractionation 40
• 11. NF-κB transactivation activity assay 41
• 12. 통계 분석 41
• Ⅲ. 연구결과 및 고찰 42
• 1. 이묘산, 황백, 창출의 항산화 효과 42
• 1) 이묘산, 황백, 창출의 추출법 비교 42
• 2) 이묘산, 황백, 창출의 DPPH radical scavenging activity 45
• 2. 이묘산, 황백, 창출이 인간 진피 섬유아세포 증식에 미치는 영향 47
• 1) 이묘산, 황백, 창출이 세포 생존율에 미치는 영향 47
• 2) 이묘산, 황백, 창출이 세포 증식에 미치는 영향 50
• 3) 이묘산, 황백, 창출이 세포 배가시간에 미치는 영향 54
• 4) 이묘산, 황백, 창출이 세포 유주능에 미치는 영향 57
• 3. 이묘산이 TNF-α로 유도된 MMP-1 발현에 미치는 영향 61
• 1) 이묘산 처리 조건이 TNF-α로 유도된 MMP-1 mRNA 발현에 미치는 영향 61
• 2) 이묘산, 황백, 창출이 TNF-α로 유도된 MMP-1 mRNA 발현에 미치는 영향 64
• 3) 이묘산이 Col1A1 발현에 미치는 영향 68
• 4) 이묘산이 MAPK 활성에 미치는 영향 70
• 4. 이묘산이 NF-κB pathway 억제에 미치는 영향 75
• 1) 이묘산의 IκB 활성화 효과 75
• 2) 이묘산의 NF-κB translocation 억제 효과 78
• 3) 이묘산의 NF-κB 전사활성 억제 효과 81
• 4) 이묘산의 IL-1β와 IL-6 발현 억제 효과 84
• 5) 이묘산과 NF-κB inhibitor의 효과 비교 87
• Ⅳ. 결론 90
• 참고문헌 94
• 국문초록 129