고지방식이 유도 지방간 마우스 모델에 Lactobacillus paracasei CH88 파라프로바이오틱스의 공급이 미치는 영향 = Effects of Lactobacillus paracasei CH88 paraprobiotics on hepatic steatosis in high-fat fed mouse model

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a group of conditions with excess fat accumulation in the liver which is not caused by excess alcohol intake. The most common form of NAFLD is fatty liver and another more serious form of NAFLD is non-alcoholic steatohepatitis (NASH) in which liver cell inflammation is accompanied by fatty liver. It has been revealed that gut microbiota composition is associated with the development of NAFLD, and therefore, the modification of gut microbiota compostion through the application of probiotics is considered as a novel therapeutic approach for the management of NAFLD. However, safety concerns of using probiotics have been raised. Paraprobiotics are defined as “inactivated microbial cells (non-viable) that confer a health benefit to the consumer. The aim of this study was to investigate the effects of different types of paraprobiotics and corresponding probiotics on hepatic steatosis in high-fat fed mouse model.
7-week-old male C57BL/6J mice were randomyly divided into 5 groups; LFD(low fat diet), HFD(high fat diet), LIVE(high fat diet+live Lactobacillus paracasei CH88), HEAT(high fat diet+heat-killed Lactobacillus paracasei CH88), LYSOZYME(high fat diet+lysozyme-treated and then sonicated Lactobacillus paracasei CH88). LFD and HFD group received sterilized PBS, LIVE group received Lactobacillus paracasei CH88 dissolved in sterilized PBS. HEAT group and LYSOZYME group received heat-killed L.paracasei CH88 and lysozyme-treated L.paracasei CH88 dissolved in sterilized PBS. Each samples were orally administered every other day for 4 weeks followed by daily administration for another 16 weeks.
Body weight was significantly increased in HFD fed groups compared to LFD group, however, there was no statistical difference between high fat diet fed groups. Liver weight was significantly higher in the HFD group compared to the LFD group. LYSOZYME group showed significantly lower liver weight compared to the HFD group. Histopathological analysis showed HFD group had higher NAFLD activity score than LFD group, while LYSOZYME group exhibited lower score than the HFD group. LYSOZYME group showed higher expressions of gut junction protein, occludin, compared to HFD group. CB1, the endocannabinoid receptor, a homeostatic regulator of energy metabolism in the body, was significantly increased in the HFD group compared to that of the LFD group and LYSOZYME treatment lowered the expression of CB1. The expression levels of the fatty acid oxidation related genes (AMPK/SIRT1/PPARa/CPT2) were upregulated in LYSOZYME group compared to those of the HFD group. Also, LYSOZYME group showed lower expressions of fatty acid uptake protein (CD36, FABP4) and pro-inflammatory cytokines (TNFα, MCP-1) compared to those of HFD group. The LYSOZYME group showed significantly lower expression of FXR compared to the HFD group and higher expression of CYP7A1, bile acid biosynthesis enzyme, compared to the HFD group. Fecal microbiota composition showed that the proportion of Firmicutes known as obesity-related bacteria phylum significantly increased in HFD group compared to LFD group, but tended to decrease in the LYSOZYME group compared to that of the HFD group. In conclusion, lysozyme-treated L. paracasei CH88 paraprobiotics may improve NALFD through modulation of gut permeability, endocannabinoid system, lipid metabolism, bile acid metabolism and gut microbiota.

국문 초록 (Abstract)

비알코올성 지방간질환(NAFLD)은 지방간에서 시작되어 비알코올성 지방 간염, 섬유증 및 간경변으로 진행되는 질환 스펙트럼이다. 질환이 진행될수록 나쁜 예후를 보인다고 알려져 있어 질환이 비가역적인 상태로 진행되기 전 초기 단계인 지방간을 중재하는 것이 중요하다. 장 내 미생물 균총과 NAFLD간 관련성이 밝혀지면서, 프로바이오틱스를 통한 장 내 미생물 균총 중재는 NAFLD의 새로운 완화요법으로 여겨졌다. 그러나 프로바이오틱스가 일부 면역력이 약한 환자나 소아에게서 부작용을 유발할 수 있음이 보고되면서 안전성 문제가 제기되었다. 이에 따라 프로바이오틱스를 사균화한 파라프로바이오틱스가 그 대체제로 주목을 받게 되었다. 최근 여러 연구들은 파라프로바이오틱스의 미생물 관련 분자패턴과 숙주세포의 패턴인식 수용체의 상호작용을 통해 파라프로바이오틱스가 프로바이오틱스와 비슷하거나 더 좋은 효과를 가질 수 있으며 파라프로바이오틱스의 효과는 비활성화 방법에 따라 달라진다고 보고하였다. 그러나 현재까지 이와 관련된 연구는 제한적으로 이루어지고 있다. 따라서 본 연구는 고지방 식이를 통해 유도한 지방간 모델에서 두가지 유형의 파라프로바이오틱스와 프로바이오틱스의 효과를 평가하기 위해 이루어졌다. 적응기간을 거친 뒤 실험동물을 무작위로 LFD(Low fat diet)군, HFD(High fat diet)군, LIVE군(High fat diet+Live L.paracasei CH88), HEAT군(High fat diet+Heat-killed L.paracasei CH88), LYSOZYME군(High fat diet+Lysozyme-treated and then sonicated L.paracasei CH88)으로 나누었다. LFD군과 HFD군에는 멸균 PBS를, LIVE군, HEAT군, LYSOZYME군에는 마리당 109cfu의 박테리아를 멸균 PBS와 혼합하여 1주차부터 4주차까지는 이틀에 한번씩, 5주차부터 20주차까지는 하루에 한번씩 시료를 공급하였다. 실험 결과 라이소자임 처리 파라프로바이오틱스의 공급은 간 무게를 유의적으로 감소시켰다. 간조직 내 지방산의 beta-oxidation에 관여하는 AMPK, SIRT1, PPARα, CPT2은 LFD군 대비 HFD군에서 발현이 유의적으로 감소했으나 HFD군 대비 LYSOZYME군에서 유의적으로 발현이 증가하였다. 또한 간조직 내 지방산 uptake에 관여하는 CD36과 FABP4는 LFD군 대비 HFD군에서 유의적으로 발현이 높았으며 HFD군 대비 LYSOZYME군에서 유의적으로 낮거나 낮아지는 경향을 보였다. 전염증성 사이토카인인 TNFα와 MCP-1은 LFD군 대비 HFD군에서 유의적으로 높았으며 LYSOZYME군에서 유의적으로 낮거나 낮아지는 경향을 보였다. 대장 조직에서 장 접합 단백질인 occludin은 LFD군 대비 HFD군에서 낮아지는 경향을 보였으며 HFD군 대비 LYSOZYME군에서 증가하였다. 간조직에서 엔도칸나비노이드 수용체인 CB1의 발현은 LFD군 대비 HFD군에서 높았으며 HFD군 대비 LYSOZYME군에서 감소하였다. 간조직 내 담즙산 수용체인 FXR은 HFD군 대비 LYSOZYME군에서 유의적으로 감소하였으며 담즙산 생합성에 관여하는 CYP7A1은 HFD군 대비 LYSOZYME군에서 유의적으로 증가하였다. 장 내 미생물 분석 결과, LYSOZYME군은 HFD군과 종 다양성에서 차이를 보이지 않았으나 비만과 관련된 phylum으로 알려진 Firmicutes의 비율이 HFD군 대비 감소하는 경향을 보였다. 본 연구를 통해 L.paracasei CH88의 lyzosyme-treated 파라프로바이오틱스가 지방간 및 염증 완화 효과를 가지고 있음을 확인하였다. 이는 장 투과도 개선 및 담즙산 생합성 증가, 미생물 조성 조절 기작에 의해 나타난 효과로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 문헌고찰 = 5
• 1. 비알코올성 지방간질환 = 5
• 2. 장내 미생물과 NAFLD = 6
• 3. 프로바이오틱스 = 10
• 4. 파라프로바이오틱스 = 13
• Ⅲ. 연구 내용 및 방법 = 18
• 1. 연구 디자인 = 18
• 2. 시료 준비 = 21
• 3. 조직병리학적 분석 = 21
• 4. 단백질 추출 및 발현량 측정 = 21
• 5. mRNA 추출 및 발현량 측정 = 22
• 6. 장내 미생물 조성 분석 = 25
• 7. 통계 분석 = 25
• Ⅳ. 결과 = 26
• Ⅴ. 고찰 = 97
• Ⅵ. 요약 및 결론 = 108
• Ⅶ. 참고문헌 = 112
• ABSTRACT = 126