The Effects of Fermented Maca Root Extracts on Anti-Melanogenesis and Skin Regeneration

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Recently, the cosmetic industry has developed rapidly, and various research fields have focused on cosmetics. In particular, the concept of the microbiome has been gaining increasing attention. The microbiome refers to the microorganisms living in the human body and their genetic information. Generally, the concept of the microbiome has been focused on the gut microbiome, but with the current research and commercialization of the skin microbiome, it is beginning to see use in cosmetics. The skin microbiome refers to the microorganism’ s present in the skin that play an important role in interactions with the external environment and their genetic information. Although not much information is available on the skin microbiome, with the recent development of genome analysis technology, microbiome research has been increasing and is being applied. Since the importance of the skin microbiome for skin health is known, the use of the skin microbiome in cosmetics is increasing. In cosmetics, the concept of the skin microbiome involved either prebiotics, which is a nutrient source of probiotics, or postbiotics, which is metabolite of microorganisms or substances produced during fermentation and is particularly used when commercializing products. Nutritional components such as vitamins and minerals exist in postbiotics. In addition, compared to before fermentation, the size of the molecular weight is smaller, so it is easily absorbed by the skin, making it suitable as a cosmetic raw material.
Maca is a biennial herbaceous plant that is involved in the regulation of various physiological activities, such as antioxidant activity, immune response regulation, and anticancer effects. Studies have shown that maca protects the skin from UV damage and promotes wound healing, but there are few studies related to the effects of maca on the skin.
This study investigated whether fermented maca root extracts could provide a safe and effective function as a cosmetic raw material for whitening and wrinkle improvement using the microbiome concept. Fermented maca root extracts was produced using Lactobacillus, and its safety as a cosmetic raw material was evaluated based on the amount of nitric oxide (NO) production, an inflammatory mediator, and cell viability. Inhibition of tyrosinase activity, melanin synthesis, and mRNA expression of genes involved in melanin synthesis was evaluated, with regard to whitening. In addition, the wound healing and collagen synthesis abilities of the fermented maca root extracts were evaluated through an in vivo experiment in relation to the wrinkle improvement effect.
To investigate the safety as a cosmetic raw material, NO production was confirmed by treating non-fermented and fermented extracts on macrophage Raw 264.7. It was confirmed that the fermented extracts produced a lower concentration of NO than the non-fermented extracts, suggesting that the fermented extracts was safer to use as a cosmetic raw material than the non-fermented extracts.
Fermented maca root extracts inhibited the activity of mushroom tyrosinase more than the non-fermented maca root extracts. In B16F10 cells, the fermented extracts showed a higher inhibition rate of tyrosinase activity and melanin synthesis compared to the non-fermented extracts. Real-Time qPCR confirmed that the fermented extracts reduced the expression of MITF, tyrosinase, and TRP2, which are involved in melanin synthesis. Collectively, the fermented maca root extracts reduced melanin synthesis by inhibiting the expression of genes involved in melanin synthesis and tyrosinase activity more effectively than the non-fermented maca extracts.
In vivo, skin regeneration and collagen synthesis of the fermented maca root extracts using L. Plantarum KCTC 3108 were similar to those of the group treated with epidermal growth factor (EGF), a cell regeneration factor used as a positive control, and higher than those of the non-fermented extracts group. In addition, the fermented maca root extracts showed a higher collagenase inhibitory activity than the non-fermented extracts in an extracellular experiment.
In conclusion, fermented maca root extracts prepared using Lactobacillus has the potential to be used as a safe and effective cosmeceutical raw material for skin whitening and wrinkle improvement.

국문 초록 (Abstract)

최근 화장품 산업이 빠르게 발달하고 다양한 연구분야가 화장품에 접목되었는데, 특히, 그 중 마이크로바이옴이라는 개념이 화장품 산업에 사용되고 있다. 마이크로바이옴이란 인체에 서식하는 미생물과 그 유전정보를 뜻하는데, 그 동안 마이크로바이옴에 대한 개념은 장 마이크로바이옴에 집중되어 연구되었지만 현재 피부 마이크로바이옴에 대한 연구와 상용화로 인해 화장품에도 마이크로바이옴 산업이 확대되었다. 피부 마이크로바이옴이란 외부 환경과의 상호작용에서 중요한 역할을 담당하고 있는 피부에 존재하는 미생물과 그 유전정보 전체를 뜻한다. 이전에는 피부 마이크로바이옴에 대한 정보와 중요성이 많이 알려지지 않았지만, 최근 유전체 분석기술의 발전으로 마이크로바이옴 연구가 활성화되면서 피부 마이크로바이옴의 기능과 인체 피부의 건강 및 질병에 있어서 핵심적인 역할을 한다는 것이 밝혀지고 있다. 이러한 피부 마이크로바이옴의 피부 건강에 대한 중요성이 알려지면서 피부 마이크로바이옴의 화장품에 대한 사용이 활발해지는 추세이다. 화장품에서는 주로 프로바이오틱스의 영양원인 프리바이오틱스나 미생물의 대사산물이나 발효 과정 중에 생산되는 물질을 의미하는 포스트바이오틱스라는 피부 마이크로바이옴 개념을 제품 상용화 시 사용하고 있다. 특히, 발효 대사산물을 포함하는 포스트바이오틱스에는 비타민, 무기질 등의 영양 성분이 존재한다고 알려져 있으며, 발효 전과 비교하여 분자량의 크기가 작아져 피부흡수에 용이하기에 화장품 원료로서 적합하다는 평가를 받고 있다.
마카는 2년생 초본식물로, 항산화, 면역반응 조절 및 항암효과와 같은 다양한 생리활성 조절에 관련하는 것으로 알려져 있는 식물이다. 마카가 UV에 의한 피부 손상을 보호한다는 연구 및 상처치유를 보인다는 연구결과가 있지만, 피부와 연관된 마카 관련 연구는 많지 않다. 본 연구는 마이크로바이옴 개념을 이용하여 마카 뿌리 발효추출물이 미백 및 주름개선에 대한 화장품 원료로서 안전하고 효과적인 기능을 제공할 수 있는지에 대한 가능성을 조사하였다. 마카 뿌리 발효추출물은 락토바실러스를 사용하여 제작하였고, 화장품 원료로의 안전성은 염증 매개물질인 NO 생성량 및 세포 생존율을 통하여 평가하였다. 미백 효능과 관련해서는 티로시나아제 활성 억제, 멜라닌 합성 억제 및 멜라닌 합성을 증가시키는 데 관여하는 유전자들의 mRNA 발현 억제를 평가하였으며, 주름개선 효능과 관련하여 in vivo 실험을 통해 마카 뿌리 발효추출물의 상처치유능력과 콜라겐 합성능력을 평가하였다.
화장품 원료로서의 안전성 확인을 위해 비 발효 및 발효 추출물을 대식세포인 Raw 264.7에 처리하여 NO 생성량을 확인하였다. 비 발효 추출물과 비교하여 발효추출물은 낮은 농도의 NO를 생성하였고, 이는 비 발효보다 발효 추출물이 화장품 원료로서의 사용에 더 안전하다고 판단된다.
마카 뿌리 발효 추출믈이 비 발효 마카 뿌리 추출물보다 버섯 유래 티로시나아제 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었고 B16F10 악성 흑색종에서도 마카 뿌리 발효추출물이 비 발효 마카 뿌리 추출물보다 티로시나아제의 활성을 억제할 뿐만 아니라, 멜라닌 합성도 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 발효추출물이 멜라닌 합성 시 관여하는 유전자 MITF, tyrosinase, TRP2의 발현을 감소시키는 것을 Real-Time qPCR을 통해 확인하였다. 종합적으로, 마카 뿌리 발효 추출물은 비 발효 마카 추출물보다 효과적으로 멜라닌 합성에 관여하는 유전자들의 발현 및 tyrosinase 활성을 억제하여 멜라닌 색소 합성을 감소시킨다는 것을 확인하였다.
동물실험에서 L.Plantarum KCTC 3108을 이용하여 만든 마카 뿌리 발효 추출물의 생체 내 피부 재생 정도와 콜라겐 합성 정도는 양성대조군으로 사용한 세포재생인자인 EGF (Epidermal Growth Factor)를 처리한 그룹과 유사했으며 비 발효 추출물보다 높았다. 또한 세포 외 실험에서 마카 뿌리 발효 추출물이 비 발효 추출물보다 콜라게네이즈 저해 활성이 높은 것으로 확인되었다.
결론적으로, 락토바실러스를 이용하여 만든 마카 뿌리 발효 추출물은 피부 미백 및 주름개선 기능이 있는 화장품 원료로서 사용 가능성이 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction = 1
• 1. Microbiome = 1
• 1.1 Skin Microbiome = 1
• 1.2. Probiotics = 2
• 1.3 Postbiotics = 6
• 2. Skin = 8
• 2.1 Skin Structure and Function = 8
• 2.2 Skin pigmentation and whitening = 11
• 2.3 Skin Wrinkles = 16
• 3. Maca (Lepidium meyenii) = 19
• 4. Research purpose = 22
• Ⅱ. Materials and Methods = 23
• 1. Materials = 23
• 1.1 Cell Lines and Culture Conditions = 23
• 1.2 Maca and Lactic Acid Strains = 23
• 1.3 Preparation of Fermented Maca Root Extracts = 24
• 2. Methods = 26
• 2.1 Cell Viability Assay = 26
• 2.2 NO (Nitric Oxide) Assay = 26
• 2.3 Mushroom Tyrosinase Inhibition Assay = 27
• 2.4 Intracellular Melanin Content Assay = 28
• 2.5 Extracellular Melanin Content Assay = 28
• 2.6 Intracellular Tyrosinase Activity = 29
• 2.7 Collagenase Inhibition Assay = 29
• 2.8 In vivo Wound Healing Assay = 30
• 2.9 Immunohistochemistry = 31
• 2.10 Quantitative Real-Time PCR = 31
• 3. Statistical Analysis = 33
• Ⅲ. Experimental Result = 34
• 1. Anti-inflammatory Effects of Fermented Maca Root Extract = 34
• 2. Anti-melanogenesis Effects of Fermented Maca Root Extracts = 39
• 2.1 Fermented Maca Root Extracts Show Higher Mushroom Tyrosinase Inhibition Effect Compared to Non-Fermented Maca Root Extracts = 39
• 2.2 Fermented Maca Root Extracts Inhibit Melanin Synthesis Compared to Non-Fermented Maca Root Extracts = 42
• 2.3 Fermented Maca Root Extracts Inhibit Intracellular Tyrosinase Activity Compared to Non-Fermented Maca Root Extracts = 48
• 2.4 Fermented Maca Root Extracts Downregulate MITF, Tyrosinase, and TRP-2 mRNA Expression in B16F10 cells. = 51
• 3. Skin Regeneration Effect of Fermented Maca Root Extracts = 54
• 3.1 Fermented Maca Root Extracts Show Better Wound Healing Effects Compared to Non-Fermented Maca Root Extracts in vivo = 54
• 3.2 Fermented Maca Root Extracts using L. Plantarum KCTC 3108 Promote Collagen Synthesis Compared to Non-Fermented Maca Root Extracts. = 60
• 3.3 Fermented Maca Root Extracts Show Higher In vitro Collagenase Inhibition Compared to Non-Fermented Maca Root Extracts = 63
• Ⅳ. Discussion = 65
• Ⅴ. Conclusion = 69
• Ⅵ. References = 72