Rett 증후군의 MECP2 유전자 변이에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

목적 : Rett 증후군이란 1966년 Andreas Rett에 의해 처음 기술되었으며 생후 6개월에서 18개월 정도까지 비교적 정상 발달을 한 후 두위 발달의 감소와 함께 습득했던 인지 및 운동능력의 상실, 언어기능의 상실, 그리고 특징적인 손동작(상동행동)을 보이는 X염색체 우성유전으로 생각되는 질환이다. 1999년 미국에서 그 결함 유전자인 MECP2(Methyl- CpG-binding protein 2) 유전자가 Xq28에서 밝혀졌으나 우리 나라에서는 이 질환에 대한 전반적 이해가 부족하며 유전자 연구는 거의 전무한 상태이다. 이에 저자들은 우리 나라의 Rett 증후군 환아에서 MECP2 유전자의 결함이 어느 정도 나타나는지를 알고자 이 연구를 시행하였다.
대상 및 방법 : 2000년 2월부터 2001년 3월까지 본원을 방문한 Rett 증후군 환아 34례의 말초혈액을 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid) 처리하여 5cc 채취하여 냉동 보관한 후 해빙하여 DNA 표본을 추출했다. DNA의 추출은 E.Z.N.A blood DNA kit(Omega Bioteck, Inc. Norcross, USA)을 사용하였다.
MECP2 유전자 네 종류의 exon은 PCR(Polymerase chain reaction)을 이용해 증폭하였고 primer sequence는 1999년 Amir 등에 의해 디자인 된 것(AF030876)을 사용하였다.
ABI 377 DNA sequencer(ABI, Foster City, California, USA)와 ABI PRISM dye cycle sequencing reaction kit(Perkin-elmer, Foster City, California, USA)을 사용하여 DNA sequencing을 시행하였고 우리 나라에서 최초로 발견된 유전자 변이에 대해서는 RFLP 분석을 통해 확인하였다.
결과 : 1)MECP2 유전자의 변이를 보인 환아는 23례로 67.6%에서 관찰되었다. 2)9종의 missense mutation과 3종의 nonsense mutation을 합해 총 12종의 유전자 변이가 관찰되었다. 3)이들 돌연 변이 중 L100V, G161E, 그리고 T311M은 전세계적으로 우리 나라에서 처음 발견된 변이이다. 4)23례의 유전자 변이는 대부분 (78.3%) MBD(Methyl-CpG-binding domain)와 TRD(Transcriptional repression domain)라는 기능영역에서 발견되었다. 5)본 연구에서 T158M, R270X, 그리고 R306C가 자주 나타나는 유전자 변이였다.
결론 : 우리 나라의 Rett 증후군 환아에서도 MECP2 유전자의 변이는 비교적 흔히 관찰되어 MECP2 유전자의 이상이 Rett 증후군을 유발하는 주 유전자 이상임이 확인되어 Rett증후군 환아의 확진을 위해 MECP2 유전자 검사가 필요할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Purpose : Rett syndrome (RTT) is a X-linked dominant neurodevelopmental disorder affecting 1 per 10,000-15,000 female births worldwide. It was initially described by Andreas Rett in 1966 and had severally studied in recently time. RTT involves developmental regression characterized stereotypic hand movements, tremors, gait apraxia, seizures, deceleration of head growth after the age of 6-18 months.
The disease-causing gene was identified as MECP2 (methyl-CpG-binding protein 2) on chromosome Xq28. MeCP2 is 76 kb and composed of 486 amino acids. The four exons of human MECP2 mRNA have a length of 1775 bp.
In this study, we carried out mutational analysis of MECP2 genes in RTT patients.
Methods : Whole blood (5cc) of 34 sporadic RTT patients was collected in EDTA-anticoagulated tubes. Genomic DNA was extracted from peripheral blood using the E.Z.N.A, blood DNA kit (Omega Bioteck, Inc. Norcross, USA).
Four exons of the MECP2 gene were amplified by PCR in 34 Korean with RTT. We carried out PCR divided the exon 3 into 2 parts and the exon 4 into 5 parts. Primer sequences designed by Amir et al. in 1999 were almost used (AF030876).
The PCR products were cleaned using QIAquick gel extraction kit (Hiden, Germany). Sequencing primers used were the same as PCR. DNA sequencing reactions were performed using an ABI 377 DNA sequencer(ABI, Foster City, California, USA) and ABI PRISM dye terminator cycle sequencing reaction kit (Perkin-elmer, Foster City, California, USA). The results were compared with the normal DNA sequence (X99686).
To confirm the change of sequence on novel mutation, RFLP analysis was performed.
Results : PCR product amplified was contained intron and exon (AF030876). The MECP2 detected mutations in 23 (67.6%) of the 34 patients. The mutations consisted of 12 different types including 9 missense and 3 nonsense mutations. Of these, three (L100V, G161E and T311M) mutations were newly identified. Most of these found mutations are located within MBD (39.1%) and TRD (39.1%). In this study, three (T158M, R270X, R306C) mutation were identified high frequency.
To confirm novel sequence change, RFLP analysis was performed. A heterozygous L100V mutation was employed a mismatch PCR. The C to G substitution at nucleotide 298 inserts a Afa I site. When the Afa I site was present, the 199 bp PCR product was cut into 170 bp and 29 bp.
The G161E (G to A) mutation in MBD of the MeCP2 gene created an Dde I restriction site. While wild type had 241 bp and 129 bp, heterogeneous mutant had 241 bp, 202 bp, 129 bp, and 39 bp fragments. T311A mutation discovered destroyed BsmB I site. The 366 bp product was digested into 198 bp and 168 bp in wild type, whereas patient with T311A had single band (365 bp).
Conclusions : MECP2 gene was also be a important cause of Korean RTT patients. MECP2 gene study is important tool for diagnosis of Korean RTT patients.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 국문초록 = i
• ABSTRACT = iii
• List of Tables = v
• Legend of Figures = vi
• I. 서론 = 1
• II. 연구 목적 = 3
• III. 대상 및 방법 = 4
• IV. 연구결과 = 5
• V. 고찰 = 8
• VI. 결론 = 12
• 참고문헌 = 13