Untersuchungen zur Interaktion zwischen dem Arabidopsis thaliana Hitzeschockfaktor 1 und den potentiell negativen Regulatoren, HSP70/HSC70 und HSBP1

국문 초록 (Abstract)

모든 세포에서는 생리적 최적온도보다 높은 온도에서 heat shock proteins(HSP)들이 합성된다. HSP의 발현은 heat shock transcription factor(HSF)가 heat shock promoter에 존재하는 heat shock element (HSE)에 결합하여 이들 유전자의 전사를 유도함으로써 이루어진다. 여러 종(種)에서의 연구 결과들은 항상 발현되고있는 HSF가 생리적 최적온도에서는 억제인자들과 결합함으로써 비활성 상태를 유지하고 있음을 암시한다. 본 논문에서는 Arabidopsis HSF1이 그 억제인자로 주목되는 AtHSP70/HSC70또는 AtHSBP1과 실제로 결합하는지를 연구하였다.
Arabidopsis의 crude extract를 사용한 EMSA 반응에 정제된 AtHSP70를 첨가하면 고분자량의 HSE:HSF:HSP70에 의한 supershift가 나타나며 이 복합체의 형성은 AtHSP70의 histidine tag에 반응하는 항체 또는 ATP를 첨가함으로써 억제되었다. Deletion construct를 이용한 yeast twohybrid 실험은 AtHSF1이 AtHSP70 뿐 아니라 AtHSC70(heat shock cognate 70)와도 결합하며 이를 위해 AtHSF1의 DNA-결합부위와 전사활성부위가 필요함을 보여준다. HSP70/HSC70에서 chaperone 기능에 필수적인 부분으로 여겨지는 C-말단의 제거는 이 결합에 아무런 영향도 미치지 않았다. 한편 정제된 AtHSF1과 AtHSP70 사이의 결합은 증명되지 못하였다. 이는 이들 단백질간의 결합이 간접적이거나 다른 보조인자를 필요로 함을 시사한다. Arabidopsis 세포 내에서의 이들 단백질의 결합을 알아보고자 in situ protein crosslinking에 이어서 HSF1:단백질복합체의 immunopreciptation이 수행되었다. 그러나 이 복합체로부터는 HSP70 보다 높은 분자량의 단백질이 HSP70-항체에 의하여 검출되었다. HSF1의 전사활성부위가 HSP70와의 결합에 필요하다는 사실과 HSP70가 heat shock 후 회복기에 HSF의 활성를 억제 한다는 사실[Lee JH, Schoffl F(1996) MGG 252:11-19]은 heat shock 후 회복기에 HSP70/HSC70가 HSF1의 전사활성부위에 결합하여 HSP 유전자의 전사를 억제함을 시사한다.
HSBP1은 동물세포에서 HSF1의 활성을 억제하는 인자로서 발견되었다. 본 논문에서는 Arabidopsis의 HSBP1-homolge를 찾아 AtHSF1과의 결합여부와 heat shock 반응에의 영향을 조사 하였다. AtHSF1과 AtHSBP1이 효모에서 동시에 발현되었으나 EMSA, coimmunoprecipitation 그리고 protein-crosslinking을 이용한 실험들에서 두 단백질이 서로 결합한다는 증거는 발견되지 않았다. HSBP1 overexpressing/ antisense Arabidopsis 식물도 역시 EMSA, HSP17.6 발현 그리고 고온저항성 테스트에서 야생종과의 차이를 나타내지 않았다. 이결과는 식물과 동물의 HSBP1과 HSF가 가지는 차이점과 관련하여 논의 되었다.

목차 (Table of Contents)

• 1. ZUSAMMENFASSUNG = 1
• 2. EINLEITUNG = 3
• 2.1. Die zellulare Streβantwort bei hoher Temperatur = 3
• 2.2. Die Hitzeschockproteine = 4
• 2.3. Die Regulation der Hitzeschockreaktion = 9
• 2.3.1. Die Hitzeschockpromotoren = 9
• 2.3.2. Die Hitzeschockfaktoren = 10
• 2.3.2.1. Die HSF-Strucktur = 11
• 2.3.2.2. Die HSF-Regulation = 13
• 2.4. Arabidopsis thaliana - das Untersuchungsobjekt = 17
• 2.5. Zielsetzung dieser Arbeit = 19
• 3. MATERIALIEN UND METHODEN = 21
• 3.1. Bakterienstamme = 21
• 3.2. Hefestamme = 21
• 3.3. Pflanzenmaterial = 22
• 3.4. Plasmide = 22
• 3.4.1. Plasmide fur E. coli = 22
• 3.4.2. Plasmide fur Hefe = 22
• 3.4.3. Plasmide fur Arabidopsis-Transformation = 22
• 3.5. Konstrukte = 23
• 3.5.1. Hsfl-Konstrukte = 23
• 3.5.2. Hsp70-Konstrukte = 24
• 3.5.3. Hsc70-Konstrukte = 25
• 3.5.4. Hsbpl-Konstrukte = 26
• 3.6. Primer = 29
• 3.6.1. Primer fur Sequenzierung und PCR = 29
• 3.6.2. Primer fur PCR-Clonierung = 30
• 3.7. Medien und Puffer = 32
• 3.7.1. Medien = 32
• 3.7.1.1. Medien fur Bakterien = 32
• 3.7.1.2. Medien fur Hefe = 32
• 3.7.1.3. Medien fUr Pflanzen = 33
• 3.7.1.3.1. Medium zur Arabidopsis-Zellkultur = 33
• 3.7.1.3.2. Medien zur Arabidopsistransformation = 34
• 3.7.1.3.3. Medien zur Pflanzenanzucht = 34
• 3.7.2. Puffer = 34
• 3.7.2.1. Puffer fur Nukleinsauren = 34
• 3.7.2.2. Puffer fur Proteine = 35
• 3.7.2.3. Puffer fur Affinitatsreinigung von Polyhistidingetagten Proteinen = 36
• 3.7.2.4. Puffer fur in vitro interaktinstest mittels Affinitatschromatographie = 36
• 3.7.2.5. Puffer fur Elektrophoresen = 37
• 3.7.2.6. Puffer fur Hefetransformation = 37
• 3.7.2.7. Puffer fur (β-Galactosidase assay (Hefe 2-Hybrid-System) = 38
• 3.7.2.8. Blotting- und Hybridisierungslosungen = 38
• 3.7.2.9. Sonstige Losungen = 39
• 3.7.2.9.1. Farbelosungen = 39
• 3.8. Sonstige Materialien = 40
• 3.8.1. Antikorper = 40
• 3.8.2. Enzyme = 40
• 3.8.3. Kits = 41
• 3.8.4. Langenstandards = 41
• 3.8.5. Chemikalien = 41
• 3.8.6. Verbrauchsmaterialien = 43
• 3.9. Kultivierungsmethoden = 44
• 3.9.1. Kultivierung von Bakterien = 44
• 3.9.2. Kultivierung von Hefen = 44
• 3.9.3. Kultivierung von Pflanzen = 44
• 3.9.3.1. Oberflachensterilisation von Samen = 44
• 3.9.3.2. Pflanzenkultur auf Festmedium = 44
• 3.9.3.3. Arabidopsis Zellkultur = 44
• 3.9.4. Hitzeschockbehandlung = 45
• 3.9.5. Transformationstechniken = 45
• 3.9.5.1. Transformation von Bakterien = 45
• 3.9.5.2. Transformation von Pichia pastoris = 46
• 3.9.5.3. Transformation von Saccharomyces cerevisiae = 47
• 3.9.5.4. Transformation von Arabidopsis-Pflanzen = 47
• 3.10. Das Hefe zwei-Hybrid-System = 48
• 3.10.1. Ko-Transformation der Koder- und Beuteplasmide = 48
• 3.10.2. Qualitatiye β-Galaktosidase Filterassays = 49
• 3.10.3. Quantifizierung der β-Galaktosidaseaktivitat = 49
• 3.10.4. Semi-Quantitative β-Galaktosidaseassays = 50
• 3.10.5. Nachweis der Expression von Kader- und Beutefusionsproteinen = 50
• 3.11. Molekularbiologische Methoden = 51
• 3.11.1. Isolierung von Nukleinsaren = 51
• 3.11.1.1. Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien = 51
• 3.11.1.2. Isolierung von mRNA aus Pflanzen = 51
• 3.11.2.Reinigung und Konzentrierung von DNA = 51
• 3.11.2.1. Phenolisierung = 51
• 3.11.2.2. Alkoholfallung = 52
• 3.11.2.3. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsauren = 52
• 3.11.3. Gelelektrophorese von Nukleinsauren = 52
• 3.11.3.1. Gelelektrophorese von DNA = 52
• 3.11.3.1.1. Agarose-Gelelektrophorese = 52
• 3.11.3.1.2. Polyacrylamid-Gelelektrophorese = 53
• 3.11.3.2. Gelelektrophorese von RNA = 53
• 3.11.4. Elution von DNA aus Gelen = 53
• 3.11.4.1. Elution aus Agarosege1en = 53
• 3.11.4.2. Elution aus Polyacrylamidgelen = 54
• 3.11.5. Restriktionsendonukleaseverdau = 54
• 3.11.6. PCR-Amplifikation von DNA = 54
• 3.11.7. DNA-Sequenzierung = 56
• 3.11.8. Klonierung von DNA = 56
• 3.11.8.1. Dephosphorylierung von DNA = 56
• 3.11.8.2. Ligation = 56
• 3.11.9. Radioaktiye Markierung von Nukleinsauren = 56
• 3.11.9.1. 3'-Endmakierung von dsDNA-Oligonukleotiden fur EMSA = 56
• 3.11.9.2. Radioaktiye Markierung von DNA uber random priming = 57
• 3.11.9.3. Radioaktiye Markierung von RNA uber in vitro-Transcription = 57
• 3.11.10. Northern Blotting = 57
• 3.11.10.1. Farbung von RNA auf Northern Blots = 58
• 3.11.10.2. Hybridisierung mit den radioaktiven Sonden = 58
• 3.11.10.3. Entfernen radioaktiyer Proben von Nylonmembranen (Stripping) = 59
• 3.12. Biochemische Methoden = 59
• 3.12.1. Isolierung von Proteinen = 59
• 3.12.1.1. Denaturierende Isolierung von Gesamtprotein aus Pflanzenmaterial = 59
• 3.12.1.2. Expression und Isolierung rekombinanter Proteine aus E. coli = 59
• 3.12.1.3. Expression und Isolierung rekombinanter Proteine aus Pichia pastoris = 60
• 3.12.1.4. Affinitatschromatographische Reinigung rekombinant exprimierter Proteine uber Ni-NTA-Agarose = 60
• 3.12.1.5. Coexpression rekombinanter AtHSF1- und AtHSBP1-Proteine in Saccharomyces cerevisiae = 61
• 3.12.2. Fallung und Konzentrierung von Proteinen = 61
• 3.12.2.1. Aceton-Fallung von Proteinen = 61
• 3.12.2.2. Konzentrierung von Proteinen uber Ultrafitration = 61
• 3.12.3. Proteinmengenbestimmung = 61
• 3.12.4. In vitro Bindungsanalyse von gereinigem HSP70 mit RCMLA = 62
• 3.12.5. Electrophoretic Mobility Shift Aassay (EMSA) = 62
• 3.12.6. Protein-Komplex-Quervernetzung mittels DSP = 63
• 3.12.7. Immunprazipitation = 64
• 3.12.8. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) = 64
• 3.12.8.1. Farbung von Gelen mittels Coomassie Brilliantblau R-250 = 64
• 3.12.9. Western Transfer von Proteinen = 65
• 3.12.9.1. Farbung von PVDF-Membranen = 65
• 3.12.10. Immunodetektion = 66
• 3.12.11. Monospezifische Reinigung von Antiseren = 66
• 3.12.12. Entfernen der Antikorper von PVDF-Membran (Stripping) = 67
• 4. ERGEBNISSE = 69
• 4.1. Untersuchungen zur Wechselwirkung von Arabidopsis thaliana HSP70 mit AtHSF1 = 69
• 4.1.1. Expression und Aufreinigung des rekombinanten AtHSP70-Proteins in Pichia pastoris = 69
• 4.1.2. Untersuchungen zur Interaktion mittels EMSA = 72
• 4.1.3. Untersuchungen zur Interaktion mittels Hefe-zwei-Hybrid-System = 76
• 4.1.4. Die Welchselwirkung zwischen AtHSF1 und AtHSP70/HSC70 in Arabidopsis thaliana = 82
• 4.2. Untersuchungen zur negativen regulatorischen Funktion des Arabidopsis thaliana HSBP1 auf AtHSF = 86
• 4.2.1. Sequenzanalyse von AtHSBP1 = 86
• 4.2.2. Expression von AtHSBP1 in Wild-Typ Arabidopsis-Pflanzen = 88
• 4.2.3. Untersuchungen zur Wechselwirkung von AtHSBP1 mit AtHSF1 = 89
• 4.2.3.1. Koexpression der AtHSF1 undAtHSBP1 in Hefe = 89
• 4.2.3.2. Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen AtHSBP1 und AtHSF1 mitte1s EMSA = 91
• 4.2.3.3. Immunprazipitation der AtHSF1-Komplexe auf Hcfe = 93
• 4.2.4. Intersuchung der AtHSBP1 uberexprimierenden Pflanzen und antisense-Pflanzen. = 95
• 4.2.4.1. Transformation und Nachweis der Transgenitat = 95
• 4.2.4.2. Einfluβ yon AtHSBPI auf die Bildung von HSE:HSF-Komplexen = 96
• 4.2.4.3. Einfluβ auf die Hitzeschockgenexpression = 98
• 4.2.4.4. Einfluβ auf die Thermotoleranz von Keimlingen = 99
• 5. DISKUSSION = 101
• 5.1. Untersuchungen zur Interaktion von AtHSF und AtHSP70/HSC70 = 101
• 5.2. Untersuchungen zur Auswirkung des AtHSBPI bei der Hitzeschock-Antwort = 105
• 6. LITERATURVERZEICHNIS = 107
• 7. ANHANG = 121
• 7.1. Konstruktkarten = 121
• 7.2. cDNA-Sequenz des Athsbpl = 125
• 7.3. Abkurzungen = 126
• 8. ENGLISH ABSTRACT = 129