무 종자 발아억제 식물내생 세균의 분리 및 동정

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Three endophytic bacterial strains YC5957, YC5965 and YC6002 with radish germination inhibitory activity were isolated from the surface sterilized roots of Glycine max and Zoysia japonica collected at Jinju area, Korea. Bioassay using radish seeds was conducted to test inhibitory activity of culture broth and filtrate of three isolates on the germination. Three isolates inhibited radish seed germination strongly when the bacteria were cultured in 1/10TSB (Tryptic Soy Broth) for 3 days at 25℃~30℃. The strain YC6002 had most strong inhibitory activity of radish seed germination. The three strains were identified based on their physiological, biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analyses. Strains YC5957 and YC5965 were identified as the species of Pseudomonas lini. The strain YC6002 was identified as a new species of the genus Arthrobacter based on taxonomic characteristics including 16S rRNA gene sequence analysis and DNA-DNA hybridization. The active compound with seed germination inhibitory activity was purified and determination of its chemical structure was attempted.

국문 초록 (Abstract)

경남 진주ㆍ사천 인근에서 채취한 다양한 식물 뿌리에서 식물내생 세균을 분리하여 무 종자 발아억제력을 조사하였다. 200여 종의 식물내생 세균중 무 종자 발아억제력이 가장 좋은 YC5957, YC5965 및 YC6002 균주를 각각 Glycine max (대두) 와
Zoysia zaponica (잔디)의 뿌리에서 순수분리하였으며, YC6002 균주가 YC5957 및 YC5965 균주에 비해 무 발아억제효과가 훨씬 좋았다.
YC5957 및 YC5965의 생리·생화학적 특성은 통성 혐기성균으로 15℃~37℃에서 생장하였고 형태는 Gram 음성, 간균 형태이었다. 2 균주의 생리ㆍ생화학적 특성과 16S rDNA 염기서열 분석 결과 Pseudomonas lini 로 동정되었다.
YC6002의 생리·생화학적 특성은 절대 호기성균으로 25℃~35℃에서 생장하는 중온성 세균이였으며 Gram 양성, V-shaped rod 형태이였다. 16S rDNA 염기서열 분석 결과 Arthrobacter 속 균주와 96~98%의 유사도를 보였으며, 추가로 DNA-DNA
hybridization 분석 결과 Arthrobacter 속의 새로운 종으로 확인 되었다.
배양 여액을 이용한 종자 발아억제력을 실험 결과 쌍떡잎 식물인 무 종자의 발아를 억제 하였다. 이 균주의 발아억제 물질 대량 생산을 위한 최적 배지 조사를 한 결과 M523, MMC, R2A broth 에서 물질의 생산이 확인 되었으나 그 중 0.1TSB 가 가장
적합하였다. 20℃, 25℃, 30℃ 배양 온도별 실험에서 모든 배양온도에서도 무 종자 발아억제를 확인 할 수 있었다. 30℃ 조건하에서 48h 동안 배양한 YC6002의 배양액과 상등액에서 발아 억제 효과가 좋았으며, 기간별 발아 억제 효과를 조사한 결과 1일
이후부터 대조구에 비해 확실한 발아 억제 효과를 보였다. 또한 발아억제 활성물질을 추출한 결과 YC-11, YC12의 추출물질에서 활성효과를 나타냈으며, TLC를 이용하여 활성물질을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 = 1
• 1. 연구 배경 및 목적 = 1
• 2. 식물내생 세균 (Endophytic bacteria) = 2
• 1) 식물내생 세균의 정의 = 2
• 2) 식물내생 세균의 분리ㆍ종류 = 2
• 3) 식물내생 세균을 이용한 생물학적 방제 = 3
• (1) 생물학적 방제 정의 = 3
• (2) 식물내생 세균에 의한 생물학적 방제 = 4
• (3) 식물내생 세균에 의한 생장 촉진 = 5
• 3. 미생물 제초제 = 5
• 1) 미생물 제초제의 정의 = 5
• 2) 국내외 연구동향 = 6
• 3) 미생물에 의한 식물 생장 억제 = 6
• 4. 식물 근권 세균 = 7
• 1) Pseudomonas sp. = 7
• 2) Arthrobacter sp. = 8
• II. 재료 및 방법 = 11
• 1. 식물내생 세균 YC5957, YC5965, YC6002의 분리 및 종자 발아억제효과 검정 = 11
• 1) 식물내생 세균의 분리 및 발아억제 조사 = 11
• 2) 식물내생 세균의 종자 발아억제 효과 조사(Bioassay) = 11
• 2. 무 종자 발아억제 세균의 동정 = 12
• 1) 세균의 형태 관찰 및 생화학적 조사 = 12
• (1) Gram 염색 및 형태 관찰 = 12
• (2) 생화학적 특성조사 = 12
• 2) 세균의 분자 생물학적 특성 조사 = 12
• (1) 16S rDNA 염기서열 분석 = 12
• (2) 계통학적 분석 = 13
• 3. 무 종자 발아억제 세균 YC6002의 지방산, 인지질 분석 및 DNA-DNA hybridization = 13
• 1) 지방산 분석 = 14
• 2) 이차원 TLC에 의한 인지질 분석 = 15
• 3) DNA-DNA hybridization = 15
• 4. 무 종자 발아억제 세균 YC6002의 발아 억제 물질 생산 조사 = 17
• 1) 무 종자 발아억제 물질 생산배지의 선정 = 17
• 2) 배양온도에 따른 무 종자 발아억제 물질 활성 조사 = 17
• 3) 무 종자 발아억제 물질 추출 = 17
• III. 결과 및 고찰 = 21
• 1. 무 종자 발아억제 세균의 선발 = 21
• 2. 무 종자 발아억제 세균의 동정 = 22
• 1) YC5957, YC5965 및 YC6002 균주의 형태, 생리학적 특성 = 22
• 2) YC5957, YC5965 및 YC6002 균주의 분자 생물학적 특성 = 25
• (1) 16S rDNA 유전자 염기서열 분석 = 25
• (2) 계통학적 분석 = 25
• 3. 무 종자 발아억제 세균 YC6002의 생화학적 특성 추가 분석 = 33
• 1) YC6002 균주 및 유사 균주의 지방산 분석 = 33
• 2) 생화학적 특성 비교 분석 = 33
• 3) 이차원 TLC에 의한 인지질 분석 = 36
• 4) YC6002와 Arthrobacter sp. 균주의 DNA-DNA hybridization = 37
• 4. 무 종자 발아억제 세균 YC6002의 발아억제 물질 생산 = 38
• 1) 무 종자 발아억제 물질의 생산 배지의 선정 = 38
• 2) 배양온도에 따른 무 종자 발아억제 물질 활성조사 = 39
• 3) 무 종자 발아억제 물질 추출 = 43
• Ⅳ. 요약 = 44
• Ⅴ. 참고문헌 = 48